[发明专利]一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法

权利要求书

1.一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法，包括下述步骤：

染色体标本制作：

(1)啤酒花植株根尖长至2-3cm，且顶端圆润饱满；

(2)切下生长旺盛的根尖2.5-3mm，用饱和对二氯苯溶液4℃下处理20-24h；

(3)按照常规方式对根尖进行低渗和固定；

(4)按照常规方式彻底清洗固定液；

(5)用1％果胶酶Y-23和4％纤维素酶Onozuka RS混合液，每个根尖15-20μl酶液，37℃酶解90min；

(6)吸取一个根尖到洗净晾干的载玻片上，体视镜下用解剖针去除根尖分生区以外的部位和杂质，轻轻敲碎根尖至浆状；

(7)在根尖上滴加10-15μl 60％冰乙酸，待液滴透明后滴加40-50μl的卡诺固定液展片，将玻片置于80℃热台上干燥5-8min；

(8)于20倍相差显微镜下镜检，挑选出背景干净、分裂相较多的染色体片做下一步荧光染色；

染色体双荧光染色：

(1)将CMA滴加到染色体片上，80-100μl/片，盖膜，避光孵育2h；

(2)在磷酸缓冲液(PBS)中清洗3-5min；

(3)将DAPI滴加到染色体片上，80-100μl/片，盖膜，避光孵育5min；

(4)在磷酸缓冲液中迅速清洗后放入抗淬灭剂Citifluor AF1中，避光保存；

(5)荧光显微镜下观察，B激发滤块下观察CMA染色的染色体，呈黄色荧光，U激发滤块下观察DAPI染色的染色体，呈蓝色荧光。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：染色体标本制作的步骤(3)中的步骤具体为：吸掉饱和对二氯苯，加0.075mol/L KCl溶液，室温下前低渗30-40min，之后加新配制的卡诺固定液，室温下固定24h-48h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：染色体标本制作的步骤(4)中的步骤具体为：将固定后的根尖用蒸馏水洗3次，每次在摇床上摇5min，充分洗去固定液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：染色后在荧光显微镜下观察，不论是雌性还是雄性啤酒花都有两个NORs，但是通过染色体双荧光染色，发现雌性啤酒花两个NORs，只有一个位点有活性，呈伸展状态，另一位点沉默，呈浓缩状态，然而在雄性啤酒花中，两个NORs都有活性，呈伸展状态。