[发明专利]一种提高大麦组培快速成苗的方法

说明书

本发明提供一种提高大麦组培快速成苗的方法，步骤如下：1）选择直径大小为1‑3cm的大麦幼胚，分别用酒精和次氯酸钠表面消毒，降低杂菌污染率；2）准确分离幼胚胚芽鞘，对盾片进行二次处理，诱导愈伤组织快速发生；3）根据幼胚的大小调整预培养和农杆菌侵染的时间，预防菌液过量；4）采用弱光遮蔽法提高绿点分化率和成苗率；5）调整愈伤诱导培养基、分化培养基和生根培养基的抗生素配比和使用时间，诱导愈伤组织快速成苗。本发明为大麦幼胚的组培方法，愈伤发生快，胚性愈伤多，可操作性强，绿点分化和成苗率高，不限于材料基因型的限制；建立的大麦幼胚转化再生体系，可为探索大麦遗传改良和细胞工程育种研究提供技术支撑。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种提高大麦组培快速成苗的方法。

背景技术

当前，国际大麦测序联盟组装完成了高质量的大麦参考基因组序列，为进一步拓宽栽培大麦基因库提供了应对策略(Mascher et al.,2017,Nature.544(7651):427-433)。作为二倍体禾本科小麦族作物，大麦是国际上公认的植物遗传研究理想的模式材料(Mayeret al.,2012,Nature.491(7426):711-716)。目前，大麦转基因技术普遍采用农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化方法，相比于基因枪法具有转化效率高、遗传稳定等优势；但该方法对材料的基因型依赖性强，转化成苗周期较长，目前仅限于欧洲栽培品种Golden Promise等少数栽培大麦品种(Wan and Lemaux,1994,Plant Physiol.104:37-48；Tingay et al.,1997,Plant J.11:1369-1376)，难以满足广泛的商业化应用和基础研究等的需求。在日益增长的基因功能研究和育种进程中，迫切需要一种更高效、更广泛、更快速的大麦组培转基因技术。

大麦幼胚仍是目前使用最广泛、最有效的遗传转化外植体，也有一些基于花药、成熟胚和叶基等作为转化材料的报道，但其可操作性和转化效率仍不如幼胚(Zhang et al.,2001,Plant J.28(4):431-441；Han et al.,2011,J Zhejiang Univ-Sci B.12(5):399-407；Yang et al.,2012,CN102577946A[P]；Liao et al.,2013,CN103421837A[P])。Bartlett等人(2008,Plant Methods.4:22)提出了一种农杆菌转化大麦幼胚的方法，通过在诱导培养基中添加Cu²⁺有效地促进了愈伤的增殖，并将Golden Promise的转化率提高到25％。但在应用实例中，受限于大麦幼胚的大小和状态，经常出现愈伤组织增长缓慢、农杆菌侵染过量难以抑制、在转移或分化培养基中绿点难以分化成苗等问题，实际成功转化一个基因所需的幼胚初始数量甚至可达上千(Zi,Hangzhou:Zhejiang University,2015)。此外，Golden Promise是上世纪六十年代培育的欧洲栽培大麦(Pakniyat et al.,1997,Plant Breeding.116:189-191)，其产量、品质和抗病等农艺性状表现远低于现有的各国主栽品种。因此，基于农杆菌介导的大麦遗传转化体系的构建需要加快愈伤增殖、提高成苗率和切实解决基因型依赖性等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高大麦组培快速成苗的方法，该方法是采用农杆菌介导的大麦幼胚转化的技术方法，能加快愈伤生成速率，缩短组培成苗所需时间，并可高效而普遍地应用于大麦不同基因型的遗传改良和基因功能研究。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

1)大麦幼胚材料的选择和灭菌：选择直径大小为1-3cm的大麦幼胚，分别用酒精和次氯酸钠表面消毒，降低杂菌污染率；

2)幼胚快速分离与愈伤增殖：准确分离幼胚和胚芽鞘，对盾片进行二次处理，诱导愈伤组织快速发生；

3)农杆菌侵染与筛选培养：根据幼胚的大小调整预培养和农杆菌侵染的时间，预防菌液过量；