[发明专利]一种体外产生环状核酸分子的方法

权利要求书

1.一种产生包含靶核苷酸序列的环状核酸分子的方法，所述方法包括：

a)提供多种包含所述靶核苷酸序列的线性核酸分子的混合物，所述多种线性核酸分子每种在两端包含独特的互补单链突出末端；

b)用核酸连接酶如T4连接酶使所述混合物中的线性核酸分子通过其互补单链突出末端而自身连接，由此自身环化形成环状核酸分子。

2.权利要求1的方法，其中所述单链突出末端包含2个、3个、4个、5个或6个或更多个核苷酸。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤a)中提供2-8种、2-32种、2-128种、2-512种、或2-2048种或更多种包含所述靶核苷酸序列的线性核酸分子的混合物。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述混合物中每种线性核酸分子的浓度为0.01-20ng/μl，优选0.01-10ng/μl，更优选0.01-5ng/μl，更优选0.01-2.5ng/μl，更优选0.01-1ng/μl。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述混合物中线性核酸分子的总浓度为0.01-200ng/μl或更高。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其进一步包括：

c)使用核酸外切酶例如T5核酸外切酶去除混合物中的线性核酸分子。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中a)中通过以下步骤提供所述多种线性核酸分子的混合物：

1)提供包含所述靶核苷酸序列的线性核酸分子；

2)将多组接头对分别连接至所述线性核酸分子，所述多组接头对每组包含5’接头和3’接头且所述5’接头和3’接头包含独特的互补单链突出末端；

3)混合并任选地纯化步骤2)中的产物。

8.权利要求1-6中任一项的方法，其中a)中通过以下步骤提供所述多种线性核酸分子的混合物：

1)用多组靶特异性引物对分别扩增获得包含所述靶核苷酸序列的线性核酸分子，每组所述引物对中的引物在5’端包含能被限制性内切酶切割并形成独特的互补单链突出末端的序列；

2)混合并任选地纯化步骤1)的扩增产物；

3)用所述限制性内切酶消化步骤2)获得的混合物；和

4)任选地纯化步骤3)的消化产物。

9.权利要求1-6中任一项的方法，其中a)中通过以下步骤提供所述多种线性核酸分子的混合物：

1)用包含通用序列标签的靶特异性引物对扩增获得包含所述靶核苷酸序列的线性核酸分子，

2)用多组针对所述通用序列标签的引物对分别扩增步骤1)获得的线性核酸分子，每组所述引物对中的引物在5’端包含能被限制性内切酶切割并形成独特的互补单链突出末端的序列；

3)混合并任选地纯化步骤2)的扩增产物；

4)用所述限制性内切酶消化步骤3)获得的混合物；和

5)任选地纯化步骤4)的消化产物。

10.权利要求8或9的方法，其中所述限制性内切酶是BbsI。

11.权利要求10的方法，所述引物对中的两种引物分别在5’端包含5’-GAAGACNNN₁N₂N₃N₄-3’和5’-GAAGACNNN₅N₆N₇N₈-3’的序列，其中N代表A、T、C和G中任一个，且序列N₁N₂N₃N₄与序列N₅N₆N₇N₈反向互补。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述环状核酸分子是minicircle DNA。