[发明专利]一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的制备方法。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，含有174个氨基酸，分子量约为20000，主要由内毒素、TNF-α和IFN-γ可活化单核细胞和巨噬细胞产生。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的基因全长2.5kb，包括5个外显子和4个内含子，G-CSF有5个半胱氨酸，Cys 36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫键，Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键对于维持G-CSF生物学功能是必须的因素。人和小鼠G-CSF在氨基酸水平上有73％同源性，并具有相互交叉的生物学活性。

粒细胞集落刺激因子主要作用于中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化和活化。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。

粒细胞集落刺激因子临床主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。

目前，检测粒细胞集落刺激因子的方法主要是酶联免疫吸附法和基因芯片。其中，酶联免疫吸附法操作繁琐、定量检测效果不佳，且结果受人为因素影响结果较大；基因芯片虽灵敏度高，但一次检测项目多，不能独立，经济费用高。

因此，目前急需一种操作简单、检测准确、成本低的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种操作简单、检测准确、成本低的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)按照下列组分含量配制试剂R1：

试剂R1：

其溶剂为纯化水；

①按照上述试剂R1的组分含量，配制MES缓冲液并调节pH；

②按照上述试剂R1的组分含量，将NaCl、NaN₃、BSA、EDTA、Tween-20、PEG-8000溶于MES缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，制得R1缓冲液；

③按照上述试剂R1的组分含量，将生物素偶联的抗体共价物溶于R1缓冲液中，搅拌均匀，即得试剂R1；

(2)按照下列组分含量配制试剂R2：

试剂R2：

其溶剂为纯化水；

①按照上述试剂R2的组分含量，配制MES缓冲液并调节pH；

②按照上述试剂R2的组分含量，将NaCl、NaN₃、BSA、甘油溶于MES缓冲液中，搅拌均匀，即得R2缓冲液；

③制备乳胶亲和素共价物：

a.取粒径为120nm的胶乳微球于MES缓冲液中，加入EDAC溶液混匀后于37℃环境中孵育混匀0.5-1.5h，离心去上清；再加入NHS溶液恢复至原体积后，混匀于37℃环境中孵育混匀0.5-1.5h，离心去上清；

b.将剩余物质分散于MES缓冲液中，加入亲和素，37℃下反应3-5h，离心，将沉淀物分散于原体积的PBS缓冲液中，反复2-4次；最后将沉淀物分散于原体积的NHS缓冲液中，加入酪蛋白；

c.2-8℃封存45-50h，得最终所需的乳胶亲和素共价物；

④用R2缓冲液来溶解得到的乳胶亲和素共价物，超声分散，最终制得试剂R2。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，试剂R1的MES缓冲液的pH为6.1。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，试剂R2的MES缓冲液的pH为7.5。

作为本发明的优选方式之一，所述制备乳胶亲和素共价物的步骤a中，采用的MES缓冲液为100mM MES缓冲液。

作为本发明的优选方式之一，所述制备乳胶亲和素共价物的步骤a中，采用的EDAC溶液为50g/L的EDAC溶液。

作为本发明的优选方式之一，所述制备乳胶亲和素共价物的步骤a中，采用的NHS溶液为50g/L的NHS溶液。

作为本发明的优选方式之一，所述制备乳胶亲和素共价物的步骤b中，加入的酪蛋白为30g/L的酪蛋白。

本发明相比现有技术的优点在于：