[发明专利]一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌的固定化方法，包括将活化的大肠杆菌接入装有培养基、经过预处理的多孔网状材料和MOPS的容器中进行固定化培养，使大肠杆菌在固定化培养过程中吸附于多孔网状材料上。本发明还公开了一种利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L‑赖氨酸的方法，包括发酵过程和补料过程，所述补料过程使用的营养成分为葡萄糖和硫酸铵。MOPS可以增强大肠杆菌在固定化材料表面的粘附效果；利用本发明的固定化大肠杆菌发酵L‑赖氨酸，L‑赖氨酸浓度由游离细胞发酵的90g/L提高至136g/L，重复发酵8批次仍能保持较高的L‑赖氨酸生产效率，平均每个批次最终L‑赖氨酸产量150g/L。

技术领域

本发明涉及利用固定化细菌发酵生产L-赖氨酸，具体涉及一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法。

背景技术

L-赖氨酸(Lysine)是脂肪族碱性氨基酸一种，化学名称为2，6-二氨基己酸，有L-型(左旋)、D-型(右旋)和DL型(消旋)三种旋学异构体，人类和动物可吸收利用的只有L-型。L-赖氨酸是人和动物生长发育所需的八种必需氨基酸之一，它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。

L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。后又出现了化学合成法、酶法，使用的合成法主要有荷兰的DMS(Dutch State Mijinen)法和日本的东丽法，合成法最大缺点是使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题。1960年，日本首先采用微生物发酵法生产，微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。氨基酸的L-型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。

近年来，随着我国赖氨酸产量的高速增长，目前已成为世界最大的赖氨酸生产国。随着L-赖氨酸的应用价值不断被发现和拓宽,一方面通过菌种的筛选和分子育种不断发掘新的菌种和改良现有的菌种，另一方面工业化生产的方法也不断地改善和更新。发酵工艺上也主要是通过连续补料实现单批次的高产量，对于使用固定化技术进行连续多批次发酵鲜有报道。目前，应用于大肠杆菌的固定方法主要是凝胶包埋法，但包埋法所用到的凝胶颗粒机械性能差、对细胞毒性作用大，而且材料本身阻碍大分子底物和氧的扩散、使用过程中杂菌污染严重等问题大大限制了此法应用于大肠杆菌耗氧发酵生产L-赖氨酸。吸附法又称载体结合法,是利用带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和粘附力等作用,而使细胞固定在载体表面和内部的方法。该方法操作简单、成本较低，但所固定的大肠杆菌数目受所用载体种类及其表面积的限制。因为大肠杆菌与载体材料作用力小易脱落的缺点很少有人采用吸附法作为大肠杆菌的固定方法。

发明内容

发明目的：为了解决大肠杆菌和载体材料表面作用力弱、粘附力低和吸附固定化效果差，本发明提供了一种大肠杆菌的固定化方法；为了解决发酵底物葡萄糖对大肠杆菌生产L-赖氨酸的抑制效应，本发明还提供了一种利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法。

技术方案：本发明所述一种大肠杆菌的固定化方法，包括将活化的大肠杆菌接入装有培养基、经过预处理的多孔网状材料和3-吗啉丙磺酸的容器中进行固定化培养，使大肠杆菌在固定化培养过程中吸附于多孔网状材料上。

所述3-吗啉丙磺酸简写为MOPS。

大肠杆菌的活化步骤如下：用无菌生理盐水洗下斜面保藏的大肠杆菌得到菌悬液，按照体积分数1％～5％的接种量将菌悬液接入含有30～100ml种子培养基的500ml三角瓶中进行培养，培养温度30～42℃，摇床转速150～250r/min，培养时间15～25h，使得培养液的OD值达到5。