[发明专利]一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明以大肠杆菌DH5α工程菌为宿主，将克隆得到的甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因依次连接在载体上得到重组质粒，并转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，诱导培养得到重组大肠杆菌。本发明的重组大肠杆菌同时含有甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因，能同时表达甲酰胺酶分解甲酰胺生成NH₄⁺和表达亚磷酸脱氢酶把亚磷酸盐氧化磷酸盐，为重组大肠杆菌工程菌提供生长繁殖所需要的氮源和磷源，而其他微生物不具备这两条获取营养途径，使重组大肠杆菌成为优势菌，解决了大肠杆菌在工业发酵中染菌问题，同时降低了发酵设备需求以及减少了抗生素的添加。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

近年来，随着发酵行业的迅速发展，发酵技术、发酵设备不断发展更新，在发酵管理经验越来越丰富，技术手段越发成熟的情况下，各企业的发酵染菌率也有下降。但工业发酵过程中染菌现象还是时有发生，并且一旦染菌，不仅造成原材料浪费，而且会影响生产效率，费事费力，破坏生产计划、扰乱生产秩序等。所以，要解决发酵中的染菌依旧是发酵企业最关切的问题之一。发酵过程通常是微生物纯种培养过程，培养过程中只允许特定的微生物生长，如果发酵过程中除目的菌以外还有其他微生物存在，就视为染菌。染菌严重影响目的菌的生长，导致发酵失败。造成发酵染菌的原因很多，除了人为操作上的原因，设备造成的发酵染菌占了很大部分。

目前关于发酵染菌的研究多集中在发酵染菌的来源(途径)及相关的菌形、不同发酵阶段染菌对发酵的影响及防治措施、从设备角度的分析和防治等方面。发酵企业为了降低染菌率，主要是从发酵设备的维护和处理入手，比如控制发酵罐空气输入系统和水循环系统无菌过滤处理，确保蒸汽消毒系统灭菌彻底，发酵环境卫生和物料处理，菌种的纯度等。但是微生物无处不在，特别是一些具有孢子结构的微生物，蒸汽消毒可能也不能把它们“杀死”。所以，在发酵工程中难免会有杂菌的污染。

针对染菌现象，研究者很少从营养物质底物谱的摄取进行研究，本研究以大肠杆菌宿主细胞作为研究对象，因为大肠杆菌是使用最广泛、最成功的表达体系。对大肠杆菌的营养代谢途径进行改造，使改造后的大肠杆菌工程菌能分解甲酰胺产生氨作为氮源和分解氧化亚磷酸盐成为磷酸盐作为磷源，改变其氮源和磷源的来源途径，使其在特定的MOPS培养基中能正常生长，而不同时具有这两条代谢途径的杂菌微生物就会由于缺乏氮源或磷源营养物质的来源而被“饿死”，从而使改造过的大肠杆菌工程菌成为特定培养基的优势菌，杂菌就不能生长繁殖。经改造的大肠杆菌优势工程菌的应用，一方面保证工程菌正常生长繁殖并表达质粒上的目标基因，另一方面还能在未灭菌的、开放式的发酵罐中进行发酵生产，而杂菌不能生长繁殖，而达到纯培养的目的。

在分子生物学中，基因的重组表达技术已经相当成熟，可以利用基因工程的手段把不同来源的基因实现在同一大肠杆菌中共表达，从而可以赋予大肠杆菌拥有其他菌株的一些特殊代谢功能，使其能在发酵工业中得到更广泛的应用，降低生产成本和设备要求。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌同时含有甲酰胺酶(FOR)基因和亚磷酸脱氢酶(PTDH)基因，能同时表达甲酰胺酶分解甲酰胺生成NH₄⁺和表达亚磷酸脱氢酶把亚磷酸盐氧化磷酸盐，为重组大肠杆菌工程菌提供生长繁殖所需要的氮源和磷源，而其他不同时具有这两条代谢途径的微生物则会由于缺乏氮源和磷源的代谢途径而被“饿死”。