[发明专利]一种用于扩增T淋巴细胞的纳米级膜性囊泡的制备方法

说明书

本发明提供了一种用于扩增T淋巴细胞的纳米级膜性囊泡的制备方法，该方法制备步骤包括：(1)，包装细胞的培养；(2)，包装细胞的灭活；(3)，灭活的包装细胞与T淋巴细胞活化混合物的共同孵育；(4)，利用挤压技术(Extrusion)将细胞悬液制备为囊泡悬液；(5)，通过密度梯度离心法分离包裹有T淋巴细胞活化混合物的膜性囊泡。该方法能够满足药品生产质量管理规范(GMP)，且容易实现批量、标准化生产。利用该方法能够以相对较低廉的成本获取数量较多囊泡；该方法能够通过人为控制囊泡内含物(T淋巴细胞活性物质)的种类和数量进而制备满足不同应用需求的膜性囊泡。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用于扩增T淋巴细胞的纳米级膜性囊泡的制备方法。

背景技术

T淋巴细胞在机体免疫中发挥不可替代的作用。目前T淋巴细胞相关的生物制品已经广泛应用于包括恶性肿瘤免疫细胞治疗在内的多个领域。因而，优化扩增T淋巴细胞方案能够推动T淋巴细胞制品在临床中的应用。

传统的符合临床应用规范的T淋巴细胞扩增方案主要依赖于满足GMP要求的T淋巴细胞活化珠子(该珠子表面粘附有活化所需的抗CD3活化抗体和抗CD28抗体)和以游离状态提供的白细胞介素2(IL-2)的共同作用。该方案在以下两个方面具有改进的需求：一，该珠子价格昂贵且技术为跨国公司垄断，提高了临床推广难度；二，该珠子生物兼容性差，为避免珠子在患者体内积累，需要在T淋巴细胞制品回输患者前去除，增加了额外的操作步骤。

囊泡是一种细胞分泌的具有磷脂双层膜结构的小囊泡。囊泡内部可以包裹蛋白、核酸等物质，可以作为生物活性物质运输或传递的天然载体(且具有较高的生物兼容性)。另外，囊泡表面存在的蛋白或磷脂可以作为运输的“向导”，能够实现囊泡内生物活性物质的靶向特定细胞递送。然而，天然分泌的囊泡因产量低，包裹物质的种类以及数量不受控制，严重制约了囊泡作为药物或者生物活性物质载体的应用。因此，探索利用物理、化学等人工手段获取大量，且能够主动包裹(或负载)特定种类、数量的生物活性物质的囊泡，使其能够满足生物医学研究及应用具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种用于扩增T淋巴细胞的纳米级膜性囊泡的制备方法，该方法能够满足药品生产质量管理规范(GMP)，且容易实现批量、标准化生产。利用该方法能够以相对较低廉的成本获取数量较多膜性囊泡，且可以通过人为控制囊泡内含物(T淋巴细胞活性物质)的种类和数量进而制备满足不同应用需求的膜性囊泡。本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供了一种用于扩增T淋巴细胞的纳米级膜性囊泡的制备方法，其特征在于，它包含如下步骤：

S1：包装细胞的培养；

S2：包装细胞的灭活；

S3：灭活的包装细胞与T淋巴细胞活化混合物的共孵育；

S4：利用挤压技术(Extrusion)制备囊泡悬液；

S5：密度梯度离心法纯化包裹T淋巴细胞活化混合物的囊泡。

优选的，步骤S1所述的包装细胞可以为除T淋巴细胞之外的原代细胞或永生化的细胞株(系)，且不限于未经基因修饰的细胞，培养在37℃、含5％的二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中进行；

优选的，步骤S2所述的细胞灭活方法可以为一定剂量的伽马射线照射(例如20-500GR)，也可以为某些化疗药物的处理(例如15ug/ml的丝裂霉素处理4个小时)；

优选的，步骤S3所述的T淋巴细胞活化混合物包括但不限于：抗CD3活化抗体(克隆号OKT3)，抗CD28活化抗体，白细胞介素2，白细胞介素7，白细胞介素15，白细胞介素21等；