[发明专利]一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂和检测试剂盒与应用

说明书

本发明公开了一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)酶联免疫检测试剂，包括包被抗体和检测抗体，包被抗体与检测抗体为兔抗人PCSK9单克隆抗体，包被抗体与检测抗体分别连接待测蛋白样品，形成双抗体夹心；包被抗体经修饰后的修饰段氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明采用重链修饰的PCSK9单克隆抗体，通过对兔单抗的重链恒定区CH3序列进行修饰提高了其与酶标板的亲和能力，亲和度更好的包被抗体在ELISA中使得待测样本的脱板游离概率大大降低，从而提高了检测结果的准确性与稳定性。该试剂盒采用的原料廉价易得且环境友好，高灵敏度、高准确度，适用于各种样本中的PCSK9检测，具有广泛的推广价值。

技术领域

本发明涉及一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂和检测试剂盒与应用，属于生物医学领域，尤其是免疫诊断技术领域。

背景技术

一、前蛋白转化酶枯草溶菌素(PCSK9)概述

前蛋白转化酶枯草溶菌素(PCSK9)是分泌型枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白酶K亚家族成员。PCSK9主要来源于人体的肝脏、肾脏和小肠。PCSK9前体蛋白主要在内质网中合成可溶性PCSK9酶原，并在内质网或高尔基体中经过自身催化裂解产生成熟的蛋白酶并分泌到血液中。目前研究表明只有肝脏分泌的PCSK9可分泌进入血液中，并与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，介导LDLR的降解，从而调节血清胆固醇水平。作为LDLR的负调节剂，过量的PCSK9在肝细胞表面结合LDLR并导致其降解，从而导致LDLR对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的结合和降解能力减弱，进而增加血清LDL-C水平，最终导致血液中胆固醇水平升高。因此，PCSK9抗体药成为治疗高胆固醇血症的最新方法。

高胆固醇血症分为家族性和非家族性，均属于脂质代谢异常，是冠状动脉疾病发生的独立危险因素。他汀类药物是目前临床上应用最广泛的降脂药物，其机制为抑制肝脏胆固醇合成过程中的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的活性从而达到降脂目的。但对于有些LDL-C水平过高或者对他汀类药物不耐受的患者，其脂质始终不能降低到正常水平。因此，还需要开发新型降脂药物单独或与他汀类药物协同使用治疗高胆固醇血症。抗PCSK9药物已成为治疗高胆固醇血症的一种新型治疗方法。目前，国外已研发中多种PCSK9单克隆抗体药物，其中安进Repatha和赛诺菲Praluent已经上市且临床疗效良好。

由于PCSK9与高胆固醇血症有着对应的比例关系，因此检测人血清中PCSK9蛋白的水平，可以作为使用PCSK9抗体药物治疗高胆固醇血症和冠心病的用药指导和病情监测。

二、PCSK9的检测现状

现有的PCSK9的检测主要是利用PCSK9的蛋白结构特异性进行检测，常规的蛋白检测方法都可以使用，目前使用较为广泛的是采用双抗夹心ELISA法进行检测，双抗体夹心法中两个抗体起到桥梁的作用，一抗(包被抗体)起到连接酶标板与蛋白的作用，二抗(检测抗体)起到连接蛋白与检测物的作用，最后通过检测检测物的有无和含量，来推导出蛋白含量，这种方法相较其他的蛋白检测方法来说，原理上可靠特异性高，操作过程简单步骤和所需仪器少，因此有不少的特异性蛋白检测试剂盒采用ELISA法，投放市场后取得了不错的反响，PCSK9检测试剂盒也已有部分面世。但这种检测方法存在检测灵敏度低、稳定性差等不足。这些问题可以通过大量的重复实验进行克服，但耗时长、需要的样本和试剂多、检测成本高，十分不利于检测试剂盒的大范围推广使用。试剂盒能否检测准确稳定取决于各方面的原因，如试剂的配比、酶标板的质量等，还有一个重要的影响因素就是抗体质量，抗体连接不稳或易被外界因素(如冲洗或震动等)干扰会大大影响检测结果的准确性。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以现有酶联免疫法的检测手段为基础，改进检测方法，获得一种检测效果好的人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂和检测试剂盒与应用。