[发明专利]一种人工转录激活因子dCas9-TV及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及一种高效的人工转录激活因子dCas9‑TV及其编码基因与应用。本发明在核酸酶失活的Cas9蛋白(dCas9)的羧基端连上多个拷贝的VP64和TAL转录激活结构域，产生一系列新型的人工转录激活因子，并筛选出转录激活活性最好的dCas9‑TV。当仅使用一个向导RNA(gRNA)靶向特定基因启动子时，dCas9‑TV能高效地激活拟南芥和水稻内源基因的转录。使用多个gRNA分别靶向多个靶基因时，dCas9‑TV能同时实现多基因的转录激活。另外，dCas9‑TV被证实在人类细胞中同样具有高效的靶向转录激活活性。利用体外组装的dCas9‑TV/gRNA核糖核蛋白复合体也能对拟南芥和水稻内源基因进行转录激活。综合以上优良活性，可将其应用基因组遗传筛选、代谢产物的生物合成通路改造、作物改良等方面。

技术领域

本发明涉及一种高效的人工转录激活因子dCas9-TV及其编码基因与应用，属于生物技术领域，特别是涉及基于基因过表达的农作物遗传改良和真核细胞代谢通路的人工调控。

背景技术

转录调控是真核生物基因表达的重要环节，能通过改变转录速率从而改变基因表达的水平。这一过程涉及众多转录调控元件的共同参与。其中，转录激活因子能促进RNA聚合酶和启动子的相互作用，提高靶基因的转录水平。转录激活因子含有DNA结合域(DNA-binding domain)和转录激活域(transcription activation domain，TAD)，前者决定转录激活因子结合DNA序列的特异性，后者则具有转录激活的活性。通过基因工程手段，人为地将多种转录激活域和可编程的DNA结合域重新融合，可以设计并产生出新型的人工转录激活因子。通过DNA结合域与特定的靶基因启动子DNA序列的结合，人工转录激活因子可以特异地激活特定基因的转录。近年来，由ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑技术衍生的人工转录激活因子被陆续报道。这些人工转录激活因子为基因功能的研究、农作物改良、真核细胞代谢物的生产、合成生物学等领域提供了重要的技术手段。其中，CRISPR/Cas9衍生的人工转录激活因子由于其简便性和易操作性，具有最广泛的应用前景。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9)系统是原核生物用于抵御噬菌体或外来质粒入侵的适应性免疫系统。近年CRISPR/Cas9系统被改造成一个革命性的基因组编辑工具，包括Cas9核酸酶和向导RNA(gRNA)两个组成部分。Cas9核酸酶能与gRNA结合，gRNA通过碱基互补配对把Cas9引导至特定的DNA序列，随后Cas9发挥其核酸酶活性，使目标DNA发生双链断裂。DNA双链断裂能引发细胞的自我修复机制，如非同源末端连接(nonhomologous end joiningrepair，NHEJ)和同源重组修复(homology-directed repair，HDR)途径。前者导致双链断裂位点附近的碱基发生随机缺失或插入；后者则利用外界提供的同源DNA片段引发同源重组，产生精确的基因片段替换。两种途径都可能产生DNA序列的改变，从而达到基因编辑的目的。

Cas9蛋白中的两个核酸酶活性中心HNH和RuvC发生点突变(D10A、H840A)后，可成为失去了DNA切割能力的dCas9(dead Cas9)。dCas9仍然保持了在gRNA的引导下特异结合靶序列的能力。当把特定的转录激活结构域(如VP64、p65)与dCas9融合后，可获得新的人工转录激活因子。当其在gRNA的引导下结合到靶基因的启动子区域时，能特异地激活靶基因的转录。