[发明专利]特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法

说明书

本发明公开了一种特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法，该方法包括如下步骤：(1)构建质粒CD144N‑GFP；(2)构建质粒TALENs，所述质粒TALENs包括质粒CD144N‑L2和质粒CD144N‑R2；(3)将质粒CD144N‑GFP和质粒TALENs同时核转ESCs，经过G418筛选，挑取单克隆之后，利用跨5’同源臂引物F1/R1及跨3’同源臂引物F2/R2进行PCR初步鉴定，鉴定双侧阳性者进行Southern blot鉴定，利用Kpn I酶切，长同源臂上探针进行杂交鉴定，阳性者即为特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法。

背景技术

人胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)为疾病建模，药物筛选和许多其他体外或体内应用提供了前所未有的优势。鉴于其独特的治疗潜力，许多研究已经制定了有效分化ESC到不同谱系细胞的方案，以避免移植未分化的ESC形成畸胎瘤。因此，建立谱系特异性报告ES/iPS细胞系对于更好地了解ES/iPS细胞的不同发育阶段，分化方案的有效优化和体内监测移植细胞存活、细胞迁移将是必不可少的。

位点特异性基因打靶是构建定点整合报告基因细胞系的有效途径。该策略依赖于目标基因组编辑和同源重组(HR)介导将外源报告基因表达框引入适当的基因组位点。这使得报告基因在内源或外源启动子的控制下永久地定点整合至基因组特定位点，而不会产生与随机整合相关联的任何不利影响。然而，ESCs中HR的低效率使得在人类ESC中的基因打靶较为困难。幸运的是，位点特异性核酸酶的出现可以帮助实现有效和特异性的基因编辑。转录激活子样效应核酸酶(TALENs)不仅可以设计和构建简单，而且具有较少的脱靶效应。因此，在本文中，我们借助TALENs来构建人类ESCs指示细胞系。

由细胞功能障碍或细胞数量减少引起的内皮细胞功能障碍导致许多疾病，如心血管疾病，肾脏疾病，血友病A等。这些疾病可以通过移植功能性内皮细胞来治疗。有许多研究使用功能性内皮细胞治疗心血管疾病和血友病A。特别是作为X连锁隐性先天性出血性疾病的血友病A被确定为基因治疗最有吸引力的候选者之一。使用经基因修正的内皮细胞是血友病A的理想治疗方法。然而，这种治疗受到人类内皮细胞来源不足和自我更新能力差的阻碍。胚胎干细胞(ESCs)因其具有自我更新能力和多谱系分化潜能可以有效解除这一限制。因此，构建可以特异性示踪内皮细胞分化的指示ESC细胞系将会发挥巨大的效用。

如上所述，目前还没有可以用来特异性示踪hESCs向内皮细胞分化的定点整合指示 ESC细胞系。如果把范围扩大的话，目前构建可以指示内皮细胞的研究倒是有不少，都是使用的随机整合策略。这种策略是一种比较粗放的方式，就是使用一个外源性克隆的内皮细胞特异性启动子加外源报告基因质粒来转染细胞，这个质粒包含了内皮细胞启动子的整个编码序列以及一个报告基因序列。整个表达框有一定几率整合到基因组中，从而表达报告基因发挥作用。其缺点有：

a.此种策略较于原位启动子处直接靶入报告基因无疑增加了质粒的大小，一般来说质粒越大，构建也越麻烦，整合效率也会降低。

而我们的策略最终整合的片段只有外源报告基因序列，减小了载体大小，技术上非常容易实现；

b.如果基因随机整合到基因组中，基因的表达可能会受到位置效应的影响，有可能表达效率低，甚至不能表达。

我们的策略是原位定点添加报告基因，就是在CD144原位启动子下游也就是起始密码子处插入报告基因编码序列，这样可以在基因原有的启动子以及调控元件下，完全指示细胞本身的实际表达情况；

c.如果质粒整合到其他内源性基因则有可能破坏内源性基因或者激活原来不表达的有害基因，从而导致不好的后果。

原位靶入报告基因策略导入的序列是精确的定点导入，不存在这种不确定性，相对安全。