[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒疫苗毒CV777与野毒株鉴别引物

说明书

一种猪流行性腹泻病毒疫苗毒与野毒株鉴别引物及其制备方法，属于猪流行性腹泻病毒的检测技术领域具体设计PEDV疫苗毒CV777与野毒株，其差异基因序列为：GTCTTCCTGTGGCACCTGAAACAA。对应引物如包括Ps1，其序列为：ACACTATACTATCCCACCG；Pa1，其序列为：TTTCAGGAGCTACATTARG；Pa2，其序列为：CACCCAAAGATCCCAAGA；其中Ps1/Pa1引物对扩增片段长度为505bp；Ps1/Pa2引物对扩增片段长度为793bp；本发明的制备方法包括步骤：RNA的提取、PEDV疫苗株与野毒株RT‑PCR鉴别、特异性试验、敏感性试验、检测结果。

技术领域

本发明属于猪流行性腹泻病毒的检测技术领域，具体是一种猪流行性腹泻病毒疫苗毒CV777与野毒株鉴别引物。

背景技术

猪流行性腹泻病是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种急性肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。其病原属于冠状病毒科冠状毒病属。猪流行性腹泻病毒可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感，尤其是哺乳仔猪，极易感染，发病率可达100％。7日龄以内的乳猪病死率高达100％，给养猪业造成了极大的经济损失。目前PEDV感染普遍，流行范围广，而预防该病的弱毒疫苗也使用较为广泛，仅靠抗体检测不能真实的反应猪群的免疫状态，因此对PEDV进行疫苗株与野毒株的鉴别诊断对于该病的免疫与预防具有重要意义。

发明内容

本研究所要解决的技术问题是，根据猪流行性腹泻病毒疫苗株CV777，野生毒株等基因组序列比对，发现在猪流行性腹泻病毒基因组2902-3696之间，野生毒株存在一段长约24bp的碱基序列，疫苗株不存在该序列。我们以这段差异序列为基础，针对PEDV基因的保守序列以及疫苗株与野毒株的差异设计引物，建立了RT-PCR鉴别方法，并初步将此检测方法应用于临床样品检测，具有良好的鉴别效果。

本研究针对的病毒为PEDV疫苗毒CV777与野毒株，其差异基因序列为：

GTCTTCCTGTGGCACCTGAAACAA。

所述引物如下。

Ps1，其序列为：ACACTATACTATCCCACCG。

Pa1，其序列为：TTTCAGGAGCTACATTARG。

Pa2，其序列为：CACCCAAAGATCCCAAGA。

其中Ps1/Pa1引物对扩增片段长度为505bp。

Ps1/Pa2引物对扩增片段长度为793bp。

一种猪流行性腹泻病毒疫苗毒与野毒株鉴别引物的应用，该应用包括一下步骤：

RNA的提取：本实验方法参照TaKaRaMiNiBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂说明书进行。

PEDV疫苗株与野毒株RT-PCR鉴别：取200μLEP管，建立50μL的一步法RT-PCR反应体系，其中PrimeScript1StepEnzymeMix需要2μL、2×1StepBuffer需要25μL、RNA模板需要8μL、Ps1、Pa1和Pa2引物2.5pmol-10pmol，、RNasefreedH2O需要11μL，混匀后离心；所述一步法RT-PCR反应条件设定为50℃45min；94℃2min；94℃30s，50℃-60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃15min；10℃停止；取7μLPCR扩增产物于1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增结果，并回收目的条带进行序列测定。