[发明专利]一种抗疲劳活性柚子皮总黄酮的制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物活性物质提取领域，具体是一种抗疲劳活性柚子皮总黄酮的制备工艺。

背景技术

自然界植物千差万别，种类繁多。它们含有大量天然有机化合物，包括一级代谢产物，也包括大量二级代谢产物。这些产物不仅对植物本身的防御、生理调节起重要作用，而且也对人类的健康做出非常重要的贡献。随着人们健康意识的不断提高，对植物来源的诸多生物活性物质重要性的认识也不断提高。

柚子皮是柚子的外皮。柚子皮富含蛋白质、有机酸、维生素以及钙等，还可用于治小儿肺炎、治疗冻疮等。其具有食用、驱除异味、防蚊虫等功效。

现有技术中柚子皮总黄酮提取方法，工艺粗糙、落后，杂质多，有效成分含量低，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作步骤简单、原料来源广，槲皮素提取率高，可快速制备得到高纯度槲皮素的抗疲劳活性柚子皮总黄酮的制备工艺。

一种抗疲劳活性柚子皮总黄酮的制备工艺，包括乙醇浸泡、超声提取、萃取和分离纯化。力竭运动引起线粒体呼吸电子传递链中电子和质子漏出，诱发氧自由基生成增加并积累，进而攻击生物膜系统引起组织细胞的结构和功能损害，造成运动能力下降，成为疲劳发生的重要因素。MDA是氧自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化产物，其含量高低能直接反映体内脂质过氧化的速率和强度。GSH-Px和SOD是体内清除氧自由基重要的抗氧化酶，SOD催化O₂^-·与H⁺反应生成H₂O₂，而GSH-Px主要催化还原型谷胱甘肽(GSH) 与H₂O₂反应，从而保护细胞膜中含巯基蛋白的还原状态。可见，SOD和GSH-Px形成连锁反应能有效地清除氧自由基并阻断脂质过氧化反应，保护组织细胞的结构和功能，SOD和 GSH-Px的水平可以间接反映机体清除氧自由基的能力。本发明得到的槲皮素可以明显提高力竭运动疲劳动物血清抗氧化酶活力，减轻脂质过氧化反应，提高动物运动能力。

作为优选，萃取步骤为：用蒸馏水将粗提取溶解后，采用乙酸乙酯多次萃取，合并萃取液，旋转蒸干后得到乙酸乙酯萃取物。粗提取与蒸馏水的质量体积比为1g：7～15mL。乙酸乙酯萃取次数为2～7次，每次用量为蒸馏水体积的2～5倍。先用蒸馏水溶解后用乙酸乙酯萃取，可除去粗提取中不溶于乙酸乙酯的水溶性物质，对槲皮素作初步纯化。槲皮素在乙酸乙酯中的溶解度远大于在蒸馏水中的溶解度，减少了槲皮素的损失。上述乙酸乙酯的用量及萃取次数，在确保槲皮素的萃取率的同时也减少了试剂的用量和浓缩干燥时的能量消耗，科学合理。

作为优选，乙醇浸泡步骤为：取干燥柚子皮粉碎，用65～80％的乙醇水溶液浸泡0.8～1.2h，柚子皮与乙醇水溶液的质量体积比为1g：1.2～2.5mL。上述乙醇水溶液的浓度及料液比科学合理，乙醇水溶液浓度过高，其他醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，影响槲皮素的提取效率。

作为优选，超声提取步骤为：在45～60℃，60～100kHZ条件下将浸泡结束的柚子皮和乙醇水溶液混合物超声提取25～35min，过滤取滤液，在25～35℃条件下旋转蒸干溶剂，得到粗提物。将提取方式改为其他方式如回流提取或将提取剂改为其他试剂如甲醇，槲皮素的提取率远没有上述方案的提取率高，说明本发明的提取方式与提取试剂之间的互相作用显著。上述提取温度、超声波频率及超声时间科学合理，槲皮素属于多羟基类化合物，提高超声温度有利于槲皮素浸出，但温度过高则影响槲皮素的稳定性，加速其被氧化破坏(槲皮素在高温下发生降解、缩合、氧化等反应)。

作为优选，分离纯化步骤为：利用柱层析和高效液相色谱分离纯化乙酸乙酯萃取物得到槲皮素单体化合物，并以标准槲皮素为对照品，经过薄层色谱点板确定产品；薄层色谱的展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝6:1。同样的展开条件下，在紫外灯下观察所测物质斑点与对照品在薄板上的斑点是否在同一位置(即斑点的Rf值是否与标样一致)，就可确认所测物质中存在槲皮素或是槲皮素的相似物，最后通过红外、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱及高分辨质谱分析进一步的论证并确定槲皮素结构。