[发明专利]一种激活和扩增NKT细胞的方法

说明书

本发明公开了一种激活和扩增NKT细胞的方法，包括以下步骤：步骤1：从外周血中分离出PBMC细胞；步骤2：将分离出的PBMC细胞经培养基重悬后，转移至经抗人CD3抗体和重组人纤连蛋白包被过的培养容器中，并向培养基中加入IFN‑γ后进行培养；步骤3：向培养基中继续加入维生素C、人血清白蛋白、IL‑2和OK432后继续培养，得到NKT细胞。本发明能显著的提高NKT细胞的纯度和与产量；且本发明提供的NKT培养方法操作简单，所耗费的成本也比较低。在培养NKT细胞的起始阶段使用CD3抗体和纤连蛋白，这能够很大程度的提高NKT的诱导效率。在NKT细胞的培养基里面加入IFN‑γ和OK432，可以显著的增加NKT细胞的杀伤能力，而且OK432能明显的促进NKT细胞的增殖能力。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种激活和扩增NKT细胞的方法。

背景技术

经典的免疫学理论认为机体的淋巴细胞有三种：T细胞、B细胞和NK(NaturalKiller)细胞，而NKT(Natural Killer T)细胞是较晚发现的第四种淋巴细胞。NKT细胞是一群细胞表面既有T细胞受体(T cell receptor,TCR)，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。NKT细胞主要分布于肝、骨髓、胸腺、脾及外周血中，在脐带血中也有NKT细胞。

NKT细胞的生物学功能主要包括免疫调节和细胞毒性作用，NKT细胞受到刺激后，可以分泌大量的白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)，γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF)，白细胞介素-13(interleukin-13，IL-13)和其它细胞因子与趋化因子，发挥免疫调节作用，NKT细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。NKT细胞活化后具有细胞毒性，可溶解靶细胞，主要效应分子是穿孔素、Fas配体和IFN-γ。NKT细胞作为具有强杀伤力的一类细胞群，具有广谱的抗肿瘤作用，已经开始广泛应用于临床治疗中，而且毒性较低。经体外培养得到的NKT细胞具有很好的抗肿瘤活性和保健作用。

目前培养NKT细胞的常规方法是在外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)的培养基中加入活化抗体和细胞因子，经过2-3周的培养得到大量的NKT细胞。但是常规培养方法得到的NKT细胞产量偏低，免疫细胞里面有大量的T细胞。大量T细胞的存在不仅降低了NKT细胞的纯度也影响了NKT细胞的增殖，所以目前急需改进现有的培养NKT细胞的工艺。

发明内容

本发明的目的是提供一种激活和扩增NKT细胞的方法，以解决常规NKT细胞培养方法存在的产量低和纯度不高的问题。

为达到上述目的，本发明提供了一种激活和扩增NKT细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1：从外周血中分离出PBMC细胞；

步骤2：将分离出的PBMC细胞经培养基重悬后，转移至经抗人CD3抗体和重组人纤连蛋白包被过的培养容器中，并向培养基中加入IFN-γ后进行培养；

步骤3：向培养基中继续加入维生素C、人血清白蛋白、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)和OK432后继续培养，得到NKT细胞。

上述的激活和扩增NKT细胞的方法，其中，在步骤2中，所述抗人CD3抗体和重组人纤连蛋白由培养基配制后对培养容器进行包被。

上述的激活和扩增NKT细胞的方法，其中，所述抗人CD3抗体的浓度为1-40μg/ml；所述重组人纤连蛋白的浓度为1-10μg/ml。

上述的激活和扩增NKT细胞的方法，其中，在步骤2中，所述包被的时间为8-24h，温度条件为0-10℃。