[发明专利]一种抑制经典Wnt/β‑catenin通路的地榆粗提物及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药的活性成分领域，具体涉及了中药地榆粗提物抑制经典的Wnt/β-catenin通路的活性成分以及制备方法。

背景技术

地榆为我国传统中药材之一，为蔷薇科地榆属植物以干燥根入药，富含鞣质，皂苷，黄酮类等天然活性成分，在抗菌抗炎，止血止泻以及抗癌等方面都有着明确的药效作用，并且对于癌症放化疗导致的机体白细胞下降具有良好的防治作用，在临床上已得到广泛的应用。

经典的Wnt/β-catenin通路是生物在维持生长发育，组织稳态等方面至关重要的信号通路，它的异常表达与多种癌症的发生，发展以及侵袭转移密切相关，因此寻找该通路的有效抑制剂成为目前治疗多种癌症的有效手段之一。从诸多文献报道中可以发现已有多个单一化合物在不同阶段对Wnt通路起抑制作用，如 XAV939通过抑制tankyrase1/2而选择性抑制Wnt通路介导的转录过程，ICG-001可拮抗Wnt/β-catenin/TCF 介导的转录过程。而相对于小分子化合物，中药提取物具有多成分的特点，从理论上讲可以从不同环节，不同靶点分别或同时作用于Wnt/β-catenin通路，且用量更少，毒性更低，更具有优势。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种抑制经典Wnt/β-catenin通路的地榆粗提物及制备方法。即对地榆粉末进行提取分离，再根据荧光素酶报告基因实验对这些粗提物进行活性筛选，在保留有效成分的情况下尽可能减少粗提物中的无活性物质。

本发明所采用的技术方案是：

1.地榆整体粗提物的制备：先对地榆干燥饮片进行粉碎过筛，以8-12倍的溶剂进行回流提取，回流温度在70℃-90℃之间，回流次数1-3次，过滤合并滤液，旋蒸回收溶剂即得。

2.地榆过大孔树脂柱不同梯度乙醇洗脱部位的制备：地榆干燥粉末用适量水溶解后，上样于D101大孔吸附树脂，不同比例乙醇-水体积比(0∶100，(40-50)∶(60-50)，90∶10)依次洗脱3-4个柱体积，收集洗脱液回收有机溶剂，冷冻干燥即得。

3.地榆各粗提物抑制Wnt/β-catenin通路的活性检测：各粗提物用超纯水配成一定浓度的溶液，在无菌环境下用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，以3T3细胞为实验对象，将细胞接种于96孔板贴壁24h，将不同药物以系列浓度处理细胞24h，利用MTT法检测药物对细胞的毒性作用。

在20％的细胞毒性浓度范围内，药物处理细胞24h，利用Steady-Glo@Assay试剂检测Wnt通路的变化程度。

本发明的有益效果是：本发明方法中寻找到了对Wnt通路具有强烈抑制效果的中药地榆提取物，并在分离纯化过程中利用大孔吸附树脂除去了50％以上的无活性成分，有利于中药提取物的质量控制。

附图说明

图1为：地榆整体水提物对3T3细胞毒性作用(图1A)，以及在wnt3a刺激剂作用下地榆整体水提物对Wnt通路的抑制活性(图1B)。

图2为：地榆过大孔树脂柱乙醇-水体积比0/100洗脱部位对3T3细胞毒性作用(图2C)，以及在wnt3a 刺激剂作用下对Wnt通路的抑制活性(图2D)。

图3为：地榆过大孔树脂柱乙醇-水体积比40/60洗脱部位对3T3细胞毒性作用(图3E)，以及在wnt3a 刺激剂作用下对Wnt通路的抑制活性(图3F)。

图4为：地榆过大孔树脂柱乙醇-水体积比90/10洗脱部位对3T3细胞毒性作用(图4G)，以及在wnt3a 刺激剂作用下对Wnt通路的抑制活性(图4H)。

图5为：地榆过大孔树脂柱乙醇-水体积比40/60洗脱部位重复三次制备所得样品的HPLC色谱图。

具体实施方式

实施例1

1.地榆整体水提物制备：

取地榆干燥粉末(过60目筛)30g加300ml的蒸馏水水浴80℃加热回流3次，每次1h，过滤合并滤液，旋蒸至膏状冷冻干燥后收集计算得率41.4％。

2.地榆过大孔树脂柱乙醇梯度洗脱部位的制备：

取地榆整体水提物2.0g用蒸馏水超声溶解30min后上样于D101大孔吸附树脂，用乙醇-水体积比为 0/100，40/60，90/10的比例依次洗脱4个柱体积，所得洗脱液回收乙醇后冷冻干燥，体积比为40％乙醇洗脱部位得率48.46％。

3.地榆过大孔树脂柱乙醇-水体积比40/60洗脱部位的HPLC分析：