[发明专利]一种嗜热古细菌的高活性DNA连接酶突变体

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体提供一种来源于嗜热古细菌Geoglobus acetivorans的DNA连接酶高活性突变体，并通过将该DNA连接酶高活性突变体导入到大肠杆菌中，构建了重组表达该DNA连接酶高活性突变体的大肠杆菌工程菌。同野生型的Geoglobus acetivorans DNA连接酶相比，该DNA连接酶高活性突变体具有更高的活性，可以作为分子生物试剂，应用于分子克隆和二代测序建库技术等方面。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体提供一种来源于嗜热古细菌Geoglobus acetivorans的DNA连接酶高活性突变体及其应用。

背景技术

DNA连接酶催化形成磷酸二酯键将两段DNA连接，在生物体内负责维护DNA的完整性，在DNA复制、重组和修复等生理活动中发挥重要的功能。根据配基的不同，DNA连接酶可以分为两大类：依赖ATP的DNA连接酶和依赖NAD⁺的DNA连接酶。依赖ATP的DNA连接酶主要分布于真核生物、古细菌和病毒中，依赖NAD⁺的DNA连接酶主要分布于细菌和部分感染真核生物的病毒中。

DNA连接酶在分子生物和生物技术领域具有广泛的应用。例如，在DNA重组构建操作中，DNA连接酶已有几十年的应用历史。近年来，来源于嗜热菌Thermus aquaticus的DNA聚合酶被应用于吉布森连接(Gibson assembly)。DNA连接酶也被应用于高通量测序建库反应和部分高通量测序反应（SOLiD测序）中。

目前被广泛使用的T4 DNA连接酶是一种依赖ATP的DNA连接酶，其对平末端的连接活性较弱，且在65度以上的温度失活。而常见的来源于嗜热菌的DNA连接酶，如Taq DNA连接酶，Pfu DNA连接酶，在高温时具有很好的活性，但是在室温条件下活性较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种在大温度范围内（20-80度）具有较高活性的DNA连接酶突变体。本发明通过构建大肠杆菌工程菌，能够高效的重组表达所述DNA连接酶突变体，同现有市售DNA连接酶相比，该酶能够在大温度范围内保持较高活性，避免了在不同温度下操作需要更换DNA连接酶的麻烦。

本发明提供了一种来源于嗜热古细菌Geoglobus acetivorans的DNA连接酶高活性突变体，包括：

氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶，以及与SEQ ID NO:1序列相似性高于95%，且具有DNA连接酶。编码所述DNA连接酶高活性突变体的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明将上述DNA连接酶高活性突变体导入大肠杆菌中，构建了重组表达该DNA连接酶高活性突变体的大肠杆菌工程菌。所述大肠杆菌工程菌能够高效的表达连接酶高活性突变体。

本发明还涉及上述DNA连接酶高活性突变体在分子生物领域的应用。

附图说明

图1，DNA连接酶高活性突变体在不同温度下的连接酶活性。其中泳道1为不加连接酶的底物（负对照），泳道2为DNA连接酶高活性突变体在80度下的反应产物，泳道3为DNA连接酶高活性突变体在50度下的反应产物，泳道4为DNA连接酶高活性突变体在20度下的连接产物。

具体实施方式

实施例1 DNA连接酶高活性突变体大肠杆菌工程菌的构建