[发明专利]一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒及其检测方法

说明书

本发明属于生物医学检验技术领域，涉及一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其中：试剂R1包括缓冲液、稳定剂、盐、表面活性剂、防腐剂、海藻糖、肝素和凝血酶；试剂R2包括缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和发色底物。将样本和去离子水以体积比1:(3‑5)混合，得稀释后样本；取稀释后样本，孵育30‑60s，加入试剂R1，混匀孵育60‑100s，加入试剂R2，混匀后，于405nm波长处检测。

技术领域

本发明属于生物医学检验技术领域，涉及一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒及其检测方法。

背景技术

抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)是一种单链糖蛋白，属于α2球蛋白，AT-Ⅲ具有分解脂蛋白的作用，对凝血系统中几乎所有的活性丝氨酸蛋白酶都有抑制作用。AT-III作为血液中活性凝血因子最重要的阻碍因子，它控制着血液的凝固和纤维蛋白的溶解。血液中抗凝血酶III的水平根据各种疾病、症状而变化。在弥散性血管内凝血(DIC)、肝疾患、肾病综合征等中降低。血液中的抗凝血酶III水平降低可能会导致肝素治疗效果无法呈现。因此，掌握抗凝血酶III的活性作为对于此类疾病的监测、病态分析、预后判定以及肝素治疗或使用抗凝血酶III浓缩制剂投药时的指标具有重要意义。

目前，测定AT-III的方法主要分为三类：免疫学分析方法、凝固法和发色底物法。

免疫学分析方法是通过单向放射免疫扩散法、免疫比浊法以及酶联免疫吸附法测定样本中AT-III的浓度。这种方法比较特异和灵敏，但是操作繁琐、耗时、准确度不高。凝固法是通过血浆凝固时间直接或间接地测定样本中AT-III活性，该方法有多种蛋白酶参与反应，测定易受影响，且操作比较繁琐、费时。发色底物法是在待测血浆中加入过量的凝血酶，凝血酶可与AT-III作用，形成无活性复合物，使凝血酶部分失活，剩余凝血酶作用于发色底物，裂解出显色基团，显色深浅与剩余凝血酶的量呈正相关，而与血浆中AT-III活性呈负相关。由于该方法灵敏度高、准确性好、检测时间短，且能够适用于多种自动化分析仪器，目前，临床上已广泛应用。

但是发色底物法也存在一定的缺陷，该法是通过加入外源性凝血酶来分析样本中AT-III活性，由于样本中也存在另一个肝素催化的凝血酶抑制剂—肝素辅助因子II(HCII)，因而测定剩余凝血酶的活性是凝血酶与AT-III和HCII反应后剩余的活性，因此，该法易受样本中HCII的干扰而导致AT-III的测定不准确。

目前市售试剂主要通过肝素酶降解肝素来降低HCII的干扰，但是该操作复杂，且肝素酶价格昂贵，大大增加了成本。还有一种是通过凝血因子Xa途径，虽然避开了肝素辅助因子Ⅱ的干扰，但是凝血因子Xa不但价格昂贵，而且稳定性较差，试剂灵敏度也没有凝血酶途径高，应用局限性很大。

发明内容

本发明针对现有发光底物法测定抗凝血酶III活性的不足，提供一种AT-III测定试剂盒及其检测方法，该试剂盒成本低廉、抗干扰能力强、灵敏度高、稳定性好，具有较广的应用前景。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其中：

试剂R1包括缓冲液、稳定剂、盐、表面活性剂、防腐剂、海藻糖、肝素和凝血酶；

试剂R2包括缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和发色底物。

试剂R1中的凝血酶可与抗凝血酶III作用，形成无活性复合物，使凝血酶部分失活，剩余凝血酶作用于R2中的发色底物，发色底物裂解出产色基团，显色深浅与抗凝血酶III活性成负相关。试剂R1中的盐、海藻糖和肝素能够降低肝素辅助因子Ⅱ的干扰，稳定凝血酶，从而提高测量的准确性。

作为优选，所述试剂R1的稳定剂为牛血清蛋白、酪蛋白、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇中的一种或多种。