[发明专利]一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法

权利要求书

1.一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法，包括冻结、切片、前处理、ATPase反应、发色、光学显微镜观察，其特征在于：

所述的冻结步骤为：将从鲤鱼背部取的样品块用冷冻保护剂清洗后放在样品台上，滴加冰冻切片包埋剂，再将样品与样品台放入装有异戊烷的容器中，并将容器放入液氮中急速冷冻至冻结点即可；冷冻保护剂的浓度为2-3%，冷冻保护剂为海藻糖和糖苷，其重量比为1:0.6-0.8，糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:83-92；

所述的切片步骤为：将达到冻结点后的样品在-20至-30℃下保持50-70min，然后切出厚度为9-11µm的切片，将收集切好的样品移至载玻片上，室温下干燥即得样品切片；

所述的前处理步骤为：将装有前处理溶液的前处理容器保持温度恒定，然后将样品切片放入前处理容器中处理，处理后倒出前处理溶液，再用清洗液清洗；

所述的ATPase反应步骤为：前处理切片中加入清洗液，然后放入18-22℃恒温槽中至温度恒定，再将清洗液完全倒出，立刻加入反应液反应，反应结束后将反应液倒出，立即加入蒸馏水清洗3-4次，再加入蒸馏水浸渍1-2min，重复浸渍6-8次，即得ATPase反应切片；

所述的发色步骤为：将ATPase反应切片用CaCl₂溶液浸泡后用蒸馏水清洗，浸渍；然后加入CoCl2溶液浸泡，结束后用蒸馏水清洗，浸渍；再用硫化铵溶液浸泡，倒出硫化铵溶液后，结束后用蒸馏水清洗，浸渍，即得发色切片；

所述的光学显微镜观察步骤为：取出发色切片，吸取多余水分，盖上盖玻片，甘油封片后，利用光学显微镜进行观察，即可辨别鲤鱼三种肌肉细胞；

所述的前处理步骤中前处理溶液含有0.09-0.11M抑胰肽酶缓冲液和17-19mMCaCl₂，前处理溶液的pH为10.40-10.60；

所述的前处理步骤中清洗液的组成为：17-19mMCaCl₂、48-52mMKCl和0.09-0.11M2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，清洗液的pH为9.35-9.45，清洗2-3次，每次清洗13-16min；

所述的ATPase反应步骤中反应液的组成为：17-19mMCaCl₂、48-52mMKCl、3.0-3.2mM ATP和0.09-0.11M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，反应液的pH为9.35-9.45，反应液的温度为18-22℃，反应时间为25-35min。

2.根据权利要求1所述的一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法，其特征在于：所述的前处理步骤中恒温温度为18-22℃，样品切片恒温处理20-30min。

3.根据权利要求1所述的一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法，其特征在于：所述的发色步骤中CaCl₂溶液浓度为0.8-1.1%，浸泡3-4min；CoCl₂溶液浓度为1.8-2.1%，浸泡3-4min；硫化铵溶液浓度为0.8-1.1%，浸泡50-70s。