[发明专利]一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法

说明书

本发明公开了一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，具体步骤为：将肌肉放入前固定液中固定，吸出前固定液，再加入NaOH溶液震荡，清洗；将样品放入单宁酸溶液中固定，清洗后用四氧化锇固定，清洗后再用冷冻保护剂溶液冲洗；接着用甲醇按浓度梯度由低到高顺序脱水；将脱水样品放入甲醇溶液中，用液氮快速冻结，切样，用叔丁醇进行置换；再将样品冷冻干燥；最后将干燥好的样品进行拍照记录。有益效果为：本发明方法能保证样品在去除细胞质后结构完整，不会使结缔组织随细胞质溶解或部分溶解，保持结缔组织的完整性，使得扫描电镜观察的结缔组织结构清晰、图像立体感强，能更好地观察到较好的细微结构特征。

技术领域

本发明涉及显微观察样品技术领域，尤其是涉及一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法。

背景技术

扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）已广泛地应用于生物学、医学、化学、环境、材料、石油地质、矿物等众多领域。随着扫描电子显微镜分辨率的不断提高和样品制备技术的逐渐完善，尤其在生物学研究中发挥了巨大作用，具有重要的实用价值。在植物学方面，观察叶表皮、种子、花粉、袍子囊和袍子等，解决形态解剖及分类问题，研究基因工程对植物的影响；在植物病理学方面，观察病原菌形态、生长状况和侵染宿主的过程，观察真菌抱子的萌发、菌丝生长，寄主植物与病原菌的相互作用，生防菌的抬抗作用等；在微生物方面，为微生物资源的利用，微生物生物技术、遗传工程、环境保护等提供了大量直观的、有科研价值的形态学依据；在动物学研究方面，观察细胞组织表面特征结构、培养细胞的形态等，研究形态与功能的关系，但在水生生物方面的研究存在一定的限制，特别对鲤鱼肌肉细胞外结缔组织显微结构观察之前的样品制备研究技术尚不成熟，通过常规的制备扫描电镜观察样品的方法获得的样品，在预处理时经常出现结缔组织随细胞质溶解或部分溶解，观察时存在结缔组织纤维结构不完整、图像不清晰的问题。

现有技术如授权公告号为CN 102607908 B的中国发明专利，公开了一种淡水鱼类精子扫描电镜样品制备方法，具体方法为：一、固定液配制；二、样品固定；三、样品台准备；四、样品滴片；五、样品镀膜，即完成淡水鱼类精子扫描电镜样品制备。上述制备方法简便、易操作，精子完整率高、分布密度适中，技术成本低，但是该制备方法会使结缔组织随细胞质溶解或部分溶解，使得扫描电镜照片不完整或不清晰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，该制备方法能够保证样品在处理时去除细胞质后扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察的结缔组织结构清晰，图像立体感强。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种制备鲤鱼肌肉细胞外结缔组织扫描电镜样品的方法，包括前固定、后固定、脱水、割断和置换、冷冻干燥、观察，制备的具体步骤为：

前固定：将鲤鱼背部肌肉避开隔膜切成块，放入前固定液中固定4-5d，每22-24h更换一次固定液，然后吸出前固定液，加入1.8-2.2M NaOH溶液震荡3-4d，每22-24h更换一次NaOH溶液，吸出NaOH溶液，再用0.09-0.11M的磷酸缓冲液清洗10-14h，即得前固定样品，上述前固定液中仲甲醛浓度为1.9-2.1%、戊二醛浓度为2.3-2.6%、磷酸缓冲液浓度为0.09-0.11M，前固定液的pH为7.0-7.3，用戊二醛和仲甲醛进行前固定效果远远好于单一戊二醛固定，穿透能力强，能更好地凝固组织细胞中的蛋白成分，利于组织坚硬，稳定细胞膜结构，使得在后续脱水过程中不易产生收缩，同时NaOH溶液的加入能除去弹性纤维和细胞质，减少杂质对结缔组织的影响，进而提高扫描电镜的清晰度，而且不会使结缔组织细胞随细胞质溶解或部分溶解，保持结缔组织细胞的完整性；