[发明专利]生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母及其构建方法。

背景技术

诺卡酮((+)-nootkatone)属于倍半萜类化合物，从努特卡柏树中首次分离t得到，也少量存在于葡萄、柚子等水果中。诺卡酮具有一种独特的香气且气味阈值很低，这一特性使诺卡酮成为一种颇受欢迎的香料并作为添加剂广泛用于食品和化妆品领域。对努特卡柏树木质的成分分析和研究表明，诺卡酮还具有杀虫、杀螨和抗菌的性能，这一性能可以使努特卡柏树在几十年的时间里对抗腐蚀。近些年，诺卡酮在医药上的应用得到了越来越多的关注。研究表明，诺卡酮具有抗血小板凝集效应、抗癌细胞增殖、提高能量代谢等作用。

从天然植物如柑橘中提取诺卡酮，受到气候、环境、收获季节多方面因素的限制，并且提取的产率极低。化学合成法又涉及用到一些有毒的重金属、易燃化合物和强效氧化剂等对环境不利的催化剂或反应物(Salvador J，et al.2002,Green Chem.4,352–356.)，所以寻找一种更高效、更环保的方法来生产诺卡酮成为人们更关注的目标。

Katarina Cankar等人发现并鉴定了一个努特卡柏树中的可以催化巴伦西亚橘烯生成诺卡酮的P450基因，CYP706M1[GenBanK数据库，序号JX518290]，该P450具有相对较高的专一性和催化效率(Katarina Cankar，et al.2014,FEBS Letters 588,1001–1007)。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌。

本发明的第二个目的是提供一种生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供上述生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌发酵生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的应用。

本发明的第四个目的是提供第二种生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌。

本发明的第五个目的是提供第二种生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法。

本发明的第六个目的是提供第二种生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌发酵生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的应用。

本发明的第七个目的是提供第三种生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌。

本发明的第八个目的是提供第三种生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法。

本发明的第九个目的是提供第三种生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌发酵生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括如下步骤：通过同源重组的方法，向解脂耶氏酵母的rDNA位点导入巴伦西亚橘烯合酶编码基因CVS表达盒、诺卡酮合酶编码基因CYP706M1表达盒和细胞色素P450还原酶的编码基因AtCPR表达盒，得到生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌1；

巴伦西亚橘烯合酶编码基因CVS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

诺卡酮合酶编码基因CYP706M1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

细胞色素P450还原酶的编码基因AtCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述方法构建的生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌1。

上述生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌1发酵生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的应用。

第二种生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括如下步骤：通过同源重组的方法，向解脂耶氏酵母的rDNA位点导入巴伦西亚橘烯合酶编码基因CVS表达盒、诺卡酮合酶编码基因与N端截短46个氨基酸的细胞色素P450还原酶编码基因的融合基因CYP706M1-tAtCPR表达盒，得到生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌2；

巴伦西亚橘烯合酶编码基因CVS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

融合基因CYP706M1-tAtCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述第二种方法构建的生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌2。

生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的重组解脂耶氏酵母菌2发酵生产巴伦西亚橘烯和诺卡酮的应用。