[发明专利]一种阿维菌素偶联的Bt杀虫毒素及其应用

权利要求书

1.一种阿维菌素偶联的Bt杀虫毒素，其特征在于：该Bt杀虫毒素的制备方法具体操作如下：按1:1.5:1.5的摩尔比分别称取4”-O-succinoyl阿维菌素、EDC和NHS，且溶于DMSO溶剂内，以对4”-O-succinoyl阿维菌素的羧基进行活化，得到活化后的4”-O-succinoyl阿维菌素，待用；取Bt Cry2Ab杀虫蛋白配制含5mmol/L Bt Cry2Ab杀虫蛋白的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液，即Bt Cry2Ab杀虫蛋白溶液，待用；分别量取配制好的活化4”-O-succinoyl阿维菌素与所述Bt Cry2Ab杀虫蛋白溶液，搅拌1小时进行偶联反应，获得Bt杀虫毒素；所述4”-O-succinoyl阿维菌素制备过程为：按摩尔质量比1:3:6称取阿维菌素、叔丁基二甲基氯硅烷和咪唑，并溶解于四氢呋喃，室温搅拌反应2小时，从而对阿维菌素的5-OH进行保护；取保护后的阿维菌素溶解于二氯甲烷中，并加入4-二甲氨基吡啶，三乙胺和琥珀酸酐，且保护后的阿维菌素、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和琥珀酸酐的摩尔比为1:4:8:16，之后避光水浴回流3小时，对阿维菌素4”-OH进行羧基化改造，用乙醚萃取产物，柱层析分离产物；取层析分离后的阿维菌素溶解于甲醇中，并加入对甲苯磺酸，且分离后的阿维菌素与对甲苯磺酸的摩尔比为1:6，室温搅拌反应30分钟进行脱保护，再采用乙酸乙酯萃取产物，最后薄层色谱分离得到产物4”-O-succinoyl阿维菌素。

2.根据权利要求1所述的一种阿维菌素偶联的Bt杀虫毒素，其特征在于：所述BtCry2Ab杀虫蛋白的制备步骤如下：

(1)将cry2Ab基因通过热击法转化至大肠杆菌工程菌以获得含有cry2Ab基因的大肠杆菌工程菌，之后将其接种至LB固体培养基上，将LB固体培养基置于30℃下恒温培养24h进行菌种活化；

(2)将活化后的大肠杆菌工程菌接种于LB液体培养基中，并置于摇瓶中37℃发酵培养，转速设定为180r/min，待菌液OD₆₀₀到达0.5后，将温度调整为25℃，180r/min继续培养24h；接着将发酵培养所得发酵液置于4℃、10000r/min条件下离心10min，离心结束后取沉淀重悬于Na₂CO₃裂解液，于4℃下超声裂解30min，裂解后的溶液于4℃、10000r/min离心30min，取上清液；

(3)将步骤(2)所得上清液过IDA-Ni亲和层析柱，并先采用Ni50缓冲液除去杂蛋白，后采用Ni500缓冲液洗脱目的蛋白；所述Ni50缓冲液的配方为NaCl 300mM、NaH₂PO₄ 50mM、咪唑50mM；Ni500缓冲液的配方为NaCl 300mM、NaH₂PO₄ 50mM、咪唑500mM；洗脱所得目的蛋白经脱盐柱PD-10脱盐则得到Bt Cry2Ab杀虫蛋白，将Bt Cry2Ab杀虫蛋白置于-20℃下保存，备用。

3.一种权利要求1所述阿维菌素偶联的Bt杀虫毒素的应用，其特征在于：所述Bt杀虫毒素作为农业杀虫剂的应用。