[发明专利]一种啶虫脒偶联的Bt杀虫毒素及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种啶虫脒偶联的Bt杀虫毒素的制备方法，其特征在于：该Bt杀虫毒素的结构式如下：

，

该制备方法的具体操作如下：按1:1.5:1.5的摩尔比分别称取羧基啶虫脒、EDC和NHS，且溶于DMSO溶剂内，以对羧基啶虫脒的羧基进行活化，得活化后的羧基啶虫脒，待用；取BtCry2Ab杀虫蛋白配置含5 mmol /L Bt Cry2Ab杀虫蛋白的Na₂CO₃/ NaHCO₃缓冲液，即BtCry2Ab杀虫蛋白溶液，待用；分别量取配制好的活化后的羧基啶虫脒与所述Bt Cry2Ab杀虫蛋白溶液，搅拌1小时进行偶联反应，获得Bt杀虫毒素；

所述羧基啶虫脒制备过程为：将巯基丙酸、氢氧化钾及啶虫脒按质量比1:1:2的比例溶于有机溶剂DMSO中，并于100℃恒温下反应2 h；反应结束后待反应体系冷却至室温，倒入盛有二次蒸馏水的洁净烧杯中，用12 mol·L^-1 HC1将反应液的pH调至3；接着反应液用二氯甲烷多次萃取，收集有机相；然后将有机相进行减压浓缩得粗产物，粗产物经硅胶柱层析分离即得所述羧基啶虫脒。

2.根据权利要求1所述的一种啶虫脒偶联的Bt杀虫毒素的制备方法，其特征在于：所述Bt Cry2Ab杀虫蛋白的制备步骤如下：

（1）将cry2Ab基因通过热击法转化至大肠杆菌工程菌以获得含有cry2Ab基因的大肠杆菌工程菌，之后将其接种至LB固体培养基上，将LB固体培养基置于30℃下恒温培养24h进行菌种活化；

（2）将活化后的大肠杆菌工程菌菌种接种于LB液体培养基中，并置于摇瓶中37℃发酵培养，转速设定为180 r/min，待菌液OD₆₀₀到达0.5后，将温度调整为25℃，180 r/min继续培养24h；接着将发酵培养所得发酵液置于4℃、10000 r/min 条件下离心 10min，离心结束后取沉淀重悬于Na₂CO₃ 裂解液，于4℃下超声裂解30 min，裂解后的溶液4℃、10000 r/min离心30 min，取上清液；

（3）将步骤（2）所得上清液过IDA-Ni亲和层析柱，并先采用Ni50缓冲液除去杂蛋白，后采用Ni500缓冲液洗脱目的蛋白；洗脱所得目的蛋白经脱盐柱PD-10脱盐则得到Bt Cry2Ab杀虫蛋白，将Bt Cry2Ab杀虫蛋白置于-20℃下保存，备用；所述Ni50缓冲液的配方为NaCl300mM、NaH₂PO₄ 50mM、咪唑 50mM；Ni500缓冲液的配方为NaCl 300mM、 NaH₂PO₄ 50mM、咪唑500mM。