[发明专利]用于化合物的羟基化的生物催化剂和方法

权利要求书

1.一种具有脯氨酸羟化酶活性的工程化多肽，所述工程化多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO:2的参考序列的残基差异为X166Q与选自由以下组成的组的至少一个残基差异的组合：X17V、X3S、X 24R/S、X25R、X26W/R、X 42L、X62Q、X66Q、X 86S、X 88R、X92V、X 98T/F、X103L、X113E、X 114N/S、X115E/S、X 131Y、X 151A/H/S、X 186G、X 188G、X 205V。

2.根据权利要求1所述的工程化多肽，所述工程化多肽具有脯氨酸羟化酶活性，其中所述氨基酸序列由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO:112、114、118、120、122、124、126、128、144和162。

3.根据权利要求1所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列包括选自以下的至少一个特征组合：

(a)X103L和X166Q；

(b)X92V、X103L和X166Q；

(c)X66Q、X103L和X166Q；以及

(d)X25R、X66Q、X92V和X115E。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的工程化多肽，所述工程化多肽能够在适当的反应条件下将底物化合物(2)，(2S)-哌啶-2-羧酸，

转化为产物化合物(1)，(2S,5S)-5-羟基哌啶-2-羧酸，

5.根据权利要求4所述的工程化多肽，其中所述多肽能够以SEQ ID NO:2的至少2倍的活性将所述底物化合物(2)转化为所述产物化合物(1)。

6.根据权利要求1-3中任一项的工程化多肽，所述工程化多肽能够将底物化合物(2)，(2S)-哌啶-2-羧酸，

转化为过量于产物化合物(1a)，(2S,3R)-3-羟基哌啶-2-羧酸

的产物化合物(1)，(2S,5S)-5-羟基哌啶-2-羧酸，

其中所述氨基酸序列包括选自以下的一个或更多个特征：X103L；X115E；和X131Y。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的工程化多肽，所述工程化多肽能够形成非对映体过量于产物化合物(1R)，(2S,5R)-5-羟基哌啶-2-羧酸

的产物化合物(1)，(2S,5S)-5-羟基哌啶-2-羧酸，

8.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1至7的任一项所述的工程化多肽。

9.根据权利要求8所述的多核苷酸，所述多核苷酸包括选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:111、113、117、119、121、123、125、127、143和161。

10.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求8或9所述的多核苷酸。

11.根据权利要求10所述的表达载体，所述表达载体还包含控制序列。

12.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求8或9所述的多核苷酸。

13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

14.一种制备权利要求1至7的任一项所述的工程化多肽的方法，所述方法包括在适合于表达所述多肽的条件下培养权利要求12或13所述的宿主细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，所述方法还包括分离所述工程化多肽的步骤。