[发明专利]利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆牛的核供体细胞的构建，特别涉及一种利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1基因定点插入获取打靶的牛胎儿成纤维细胞的方法。

背景技术

结核病是一种由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)在人与牛之间传播引起的世界性人畜共患病，对畜牧业生产安全、畜产品安全乃至人类健康造成了严重威胁。

Ipr1(intracellular pathogen resistance 1,细胞内病原体抵抗因子1)基因是目前已发现的介导结核分枝杆菌天然免疫的一个基因，该基因能够限制结核分枝杆菌在巨噬细胞内的繁殖，并且能调节巨噬细胞的死亡方式(Behar,2011)。Ipr1基因的发现为预防牛结核病的流行和传播提供了一种新思路。研究发现牛Ipr1基因上的SNP可能与牛副结核的易感性相关。如果牛自身表达的Ipr1基因也具有抗结核的功能，那么从转基因动物的生物安全性角度考虑，转牛自身的Ipr1基因会是更好地选择。

2013年2月，国际著名期刊《Cell》报道了加州大学旧金山分校的研究人员所发现的一种精确沉默基因的方法，称之为CRISPR/Cas9介导的打靶技术。该技术表现出许多优越性，例如可以同时沉默任意数量的基因、具有优良的靶向性、构建简单且成本低等。该技术自发明以来，迅速被广大中外研究人员应用于人类细胞以及小鼠等模式动物研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点。

应用转基因技术实现家畜的品种改良具有巨大的应用潜力。通过转基因技术增强家畜对于结核杆菌的抗性，对于未来的牛结核病的预防和治疗具有重大意义。然而，目前CRISPR/Cas9技术介导的基因插入在转基因家畜中的应用非常有限。此外，如何在保证外源基因插入效率的同时，减弱该系统多变的脱靶效应至今依然亟待解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，可以采用Cas9与Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体获取Ipr1基因在牛25号染色体F-A位点(即牛FSCN1基因和ACTB基因间区域内特定序列片段)定点整合的牛胎儿成纤维细胞，以该细胞作为核供体细胞，为研制抗结核病的转基因牛提供坚实的基础。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体(简称pIpr1-eGFP-P2A-Puro)，该打靶载体包括目的基因Ipr1以及用于将Ipr1基因通过同源重组定点插入牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列。

所述元件序列包括用于打靶位点同源重组的同源臂序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛25号染色体上打靶位点的上游577-977bp和下游616-1016bp；打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。

所述目的基因Ipr1是由巨噬细胞清道夫受体1启动子启动转录。

所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。

所述元件序列还包括位于两个筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列。

一种插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞的构建方法，包括以下步骤：以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体，将目的基因Ipr1定点整合到牛胎儿成纤维细胞的25号染色体FSCN1和ACTB基因间。

所述宿主细胞为传代2～3代的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞，以兼顾细胞数量与活性。

所述共转染操作采用电穿孔法。

所述CRISPR/Cas9表达载体包含有与打靶位点相对应的向导序列，打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。

所述插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞可作为生产转基因克隆牛的核移植操作供体细胞使用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.本发明构建了一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro，并通过基因打靶技术使Ipr1基因定点整合到牛25号染色体F-A位点。该位点附近基因簇为持家基因，在不同组织中均处于活跃表达状态。将Ipr1插入该区域，可以避免其因异染色质化修饰而丧失活性。