[发明专利]一种利用磁性纳米探针肉眼直接计数大肠杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于病原体检测领域，具体涉及一种利用暗场显微镜肉眼直接观察大肠杆菌的方法。

背景技术

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常被称为大肠杆菌，为埃希氏菌属的代表菌种。有鞭毛及动力，为无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。自1885年Esherich发现大肠埃希氏菌以来，人们通常将其认作肠道菌群中的正常组成部分。直到1982年，Riley和Remis等首次发现大肠杆菌具有致病性。致病性大肠杆菌是重要的腹泻病原之一，属于人畜共患病原体，严重危害人类的公共卫生健康。大肠杆菌在环境中广泛存在，可通过水源、畜禽产品和环境中的各种其它因素如动物接触、公共环境污染等进行传播造成疾病暴发。研究表明，饮用水、食品中大肠杆菌的数量，可作为其安全程度的重要指标。因此，大肠杆菌的检测具有重要的公共卫生意义。

传统大肠杆菌检测主要有两种方法，一种需要进过提取分离培养，细菌形态鉴定等步骤较为繁琐。然而，这种技术具有局限性，多种细菌并不具可供鉴定的形态学特征；细菌培养技术本身会引入很大的误差，重复性低。传统的大肠杆菌检测方法耗时较长且操作复杂，不适合进行食品检疫等大批量样品的检测。医疗中，如果检测时间过长也可能会导致诊治的延迟。另外一种，实时荧光定量PCR，可将细菌样品的特异性DNA进行扩增，同时进行荧光定量检测。但这种方法极易产生非特异性产物，从而形成假阳性结果。除此之外，PCR检测需要具有专业的实验技术和仪器，需要专业的技术人员，限制了其在基层工作中的使用。

发明内容

本发明的目的在于建立一种利用暗场显微镜肉眼观察大肠杆菌的快速检测方法，该方法能够对环境中的大肠杆菌进行快速诊断和检测，缩短检测周期，简化检测过程，提高检测手段的普遍适用性，利于实地现场检测，从而快速、准确、敏感、简便地检测大肠杆菌的存在，及时防控，意义重大。

本发明首先将抗体和磁珠进行偶联，构建具有特异性捕获大肠杆菌的磁探针。此探针利用抗原抗体的特异性反应，可紧密结合大肠杆菌，该复合物在磁场的作用下做定向运动，从而达到分离大肠杆菌的作用，在暗场显微镜下可形成清晰为肉眼所见的金黄色衣壳状结构。

本发明采用的技术方案如下：

一种利用暗场显微镜肉眼直接观察大肠杆菌的方法，该方法是将商品化大肠杆菌抗体和商品化包被有蛋白A的磁珠进行亲和偶联获得磁探针，然后以此探针对环境中大肠杆菌进行捕获，然后在暗场显微镜下观察结果。

本发明具体的步骤如下：

(1)磁珠的清洗：将包被有蛋白A的磁珠进行清洗，获得分散性较均一的纳米级磁珠；

(2)抗体的偶联：将大肠杆菌抗体和步骤(1)中清洗后的磁珠混合，亲和偶联后获得具有特异性捕获大肠杆菌的磁探针；

(3)将步骤(2)中磁探针与待测样本孵育一段时间，得混合液；

(4)磁分离上述混合液，用PBS重悬混合物后，滴加到载玻片上，暗场显微镜观察。

优选地，所述方法，步骤如下：

(1)磁珠的清洗：将包被有蛋白A的磁珠与含有BSA的PBS溶液进行混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于含有BSA的PBS溶液中，超声后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于含有BSA的PBS溶液中，获得分散性较均一的磁珠；

(2)抗体的偶联：将商品化大肠杆菌抗体和步骤(1)中清洗后的磁珠按照质量比为1:1-2:5混合，常温孵育1-6h；然后磁分离洗涤未结合抗体，最后用含BSA的PBS溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得具有特异捕获大肠杆菌的磁探针；

(3)用步骤(2)构建好的磁探针对待测样品中的大肠杆菌进行捕获，所述磁探针添加量为每100μL样本溶液加入50-100μL磁探针；

(4)取步骤(3)中的混合液滴加到载玻片上，暗场显微镜观察。

本发明中，步骤(1)所述磁珠是直径为纳米级的磁颗粒。

步骤(1)所述磁珠清洗所用的BSA的浓度为1％，每次清洗的时间为5min，清洗次数为3次。

步骤(2)所述抗体和磁珠偶联时间为30-60min。

步骤(3)所述样品，为水样、乳制品和粪便样品。

步骤(3)所述磁探针捕获大肠杆菌的时间为30-60min。

更优选地，所述方法，具体步骤如下：