[发明专利]一种检测贝氏柯克斯体的重组酶聚合酶恒温扩增方法、专用引物和探针及应用

说明书

本发明提供了用于检测贝氏柯克斯体的RPA检测方法，其专用引物、探针及其在贝氏柯克斯体检测中的用途。所述检测方法、其专用引物和探针及基于贝氏柯克斯体23S rRNA基因保守序列设计，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明首次将新型恒温扩增技术RPA应用于贝氏柯克斯体的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合，包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，对DNA模板进行扩增，可在25‑43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。本发明具有高灵敏度、高特异性，且对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测等优点，适于推广应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及贝氏柯克斯体的分子生物学及其检测方法和用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术（RPA技术）快速检测贝氏柯克斯体的方法、其专用引物和探针及其用途。

背景技术

贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii，Cb），俗称Q热立克次体，为Q热的病原体，是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，贝氏柯克斯体对外界环境抵抗力强、存活时间长，人类和动物普遍易感，且可通过气溶胶广泛传播，是高致死性的病原体之一。贝氏柯克斯体可引发人类急、慢性Q热，主要通过呼吸道进入体内引起人和动物感染，仅吸入少量贝氏柯克斯体就可致病，感染的家畜牛、羊为主要传染源，猫、狗等宠物和啮齿动物鼠及节肢动物蜱、螨等均可传播该病。第二次世界大战期间该病曾多次暴发流行，目前Q热已成为世界上分布最广的人兽共患病之一。

Q热临床表现为发热、头痛、肌肉酸痛，无特异性，与其他呼吸道感染难以区分，误诊和漏诊情况严重。目前，对贝氏柯克斯体的检测方法主要包括平板分离培养法、血清学技术、荧光定量PCR法。但是，这些方法存在成本较高、需要特定设备、耗时且需对样品进行复杂处理等缺陷，导致它们的实际应用范围严重受限。建立一种简单、快速、适合现场应用的贝氏柯克斯体的检测方法有重要意义。

近年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶恒温扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，其是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在25 - 43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测贝氏柯克斯体的特异性引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测贝氏柯克斯体的检测方法。

因此本发明的第一个目的是提供用于检测贝氏柯克斯体的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据贝氏柯克斯体的保守基因23S rRNA（GeneBank：NR_076084）设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了贝氏柯克斯体23S rRNA基因的保守区：第2347位到第3388位核苷酸序列，此区域含有1042个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选的引物长度为30bp以上。

所述引物包括正向引物cbF399和反向引物cbR564，共两条，分别具有如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列，分别为贝氏柯克斯体的保守基因23S rRNA（GeneBank：NR_076084）的第2745到2774位核苷酸序列和第2881到2910位核苷酸序列，其中反向引物5’端标记生物素（Biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链DNA将标记有生物素。