[发明专利]一种基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法

权利要求书

1.一种基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法，其特征在于，步骤如下：

a、基底的制备：取一块一侧面制作有多个条带的聚二甲基硅氧烷模具板，多个条带平行设置且相邻条带之间设有模具凹槽；取树脂预聚体覆盖在聚二甲基硅氧烷模具板带有条带的一侧面上，固化得到带有条带的基底；

b、金膜沉积：在基底一侧面的条带上沉积金属金，得到沉积金膜的基底；

c、样品模块的制备：将沉积金膜的基底切割成矩形块，置于聚乙烯模具的矩形凹槽当中，添加树脂预聚体，固化后形成长方体样品模块；

d、二维金纳米线阵列结构制备：将上述样品模块的金膜一侧修整成适合金刚石刀宽度的尺寸，并将修整后的样品模块固定于超薄纳米切片机中，利用金刚石刀沿平行于基底条带一侧的方向切割样品模块得到切割薄片，然后将切割薄片收集到载体上，得到二维金纳米线阵列结构；

e、三维金纳米线阵列结构制备：利用聚苯乙烯膜作为载体，金属铝层作为牺牲层的纳米转移技术，将一包含二维金纳米线阵列结构的切割薄片转移到另一位于载体上的二维金纳米线阵列结构的切割薄片，并控制纳米线取向；将载有样品的载体置于反应性离子刻蚀机中，氧反应性离子刻蚀除去环氧树脂基体以及聚苯乙烯膜，得到交叉角度从0～90°变化的三维金纳米线阵列结构；

f、人骨髓间充质干细胞的培养：人骨髓间充质干细胞置于包含胎牛血清和抗坏血酸的培养基中生长；人骨髓间充质干细胞生长到80～90％时收集于T75培养瓶中，再用胰蛋白酶进一步培养；

g、金纳米线阵列对细胞行为引导：利用乙醇对步骤e中制备的包含不同交叉角的三维金纳米线阵列结构进行杀菌处理，并置于24孔细胞培养板中静置整夜，将人骨髓间充质干细胞加到载体上的三维金纳米线阵列结构进行细胞粘附，然后放置于培养箱中，除去没有粘连的细胞，再向培养板中加入新鲜培养基继续培养，将人骨髓间充质干细胞于PBS中利用多聚甲醛固定，再用PBS冲洗，然后利用TritonX-100溶液通透细胞膜，再通过含有BSA的PBS溶液处理细胞以阻止非特异性结合；除去BSA溶液，利用异硫氰酸荧光素、DAPI和罗丹明标记鬼笔环肽对黏着斑蛋白、细胞核和纤维状肌动蛋白着色；

所述的步骤a中的聚二甲基硅氧烷模具板一侧的条带通过刻蚀或者纳米压印技术在平整硅表面制得；步骤a中树脂预聚体覆盖在聚二甲基硅氧烷模具板上的固化时间为2至10h，固化温度为50～80度；步骤a中基底一侧条带的间距为5～200μm、宽度为5～200μm、高度为1～20μm。

2.根据权利要求1所述的基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法，其特征在于，所述的树脂预聚体为环氧树脂或硫醇烯类光固化树脂；所述的树脂预聚体中包含固化剂；所述的树脂预聚体和固化剂的比例为15：2。

3.根据权利要求1所述的基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法，其特征在于，所述的步骤b中将基底置于真空条件下，以的速度电子束沉积金属金，沉积厚度为10～200nm。

4.根据权利要求1所述的基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法，其特征在于，所述的步骤c中固化温度为50～80℃、固化时间为2～10小时。

5.根据权利要求1所述的基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法，其特征在于，所述的步骤d中利用2～4mm宽的金刚石刀，以0.6～1.2mm/s的速度沿平行于基底条带的方向切割样品模块得到厚度50～300nm的切割薄片；所述的载体为玻璃、硅片、金片中的一种。

6.根据权利要求1所述的基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法，其特征在于，所述的步骤e中刻蚀时间5～20min，刻蚀气压为5～10mTorr，刻蚀温度10～20℃，氧气流速10～50sccm，刻蚀功率为100～200W。

7.根据权利要求1所述的基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法，其特征在于，所述的步骤f的培养基中胎牛血清浓度为5～15％胎牛血清，抗坏血酸浓度为0.05～0.2％，培养温度为36～38℃，CO₂浓度为3～7％；采用胰蛋白酶于36～38℃温度下进一步培养3～5分钟。

8.根据权利要求1所述的基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法，其特征在于，所述的步骤g中，用于杀菌的乙醇浓度为60～80％；以每孔1×10⁴～3×10⁴个细胞密度将人骨髓间充质细胞加到载体上进行细胞粘附；控制培养箱中的温度为36～38℃，CO₂浓度为3～7％，培养时间为1～2小时；每孔中加入1～3mL新鲜培养基继续培养1～3天；在室温条件下细胞在PBS中利用3～4％的多聚甲醛固定10～30分钟，再用PBS冲洗2～5次，然后利用0.1～1％的TritonX-100溶液通透细胞膜3～5分钟，通过含有3～10％BSA的PBS溶液处理细胞20～40分钟以阻止非特异性结合。