[发明专利]一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学检验技术领域，涉及一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂盒及其检测方法。

背景技术

脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA₂)是磷脂酶A2超家族的成员之一，由441个氨基酸组成，相对分子质量为45KDa。因其最初发现时能降解血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)的活性，也被称为血小板活化因子乙酰水解酶(platelet-activating factor acetylhydro-lase，PAF-AH)。人血浆Lp-PLA₂主要由巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞以及肥大细胞等分泌产生，并受γ干扰素、脂多糖、血小板活化因子等多种炎性因子的调节。早期研究中，Lp-PLA₂能将PAF水解为无活性的溶血PAF，减少炎症和血栓的形成，认为其具有抗炎和抗动脉粥样硬化的作用。但近年来的临床及实验室研究已经证实，Lp-PLA₂在血浆中占主要优势的作用是水解氧化卵磷脂。Lp-PLA₂能通过水解动脉内膜上氧化低密度脂蛋白(LDL)上的氧化磷脂而生成溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，Lyso-PC)和氧化型游离脂肪酸(oxidized free fatty acids，ox-FA)，这两种促炎介质能刺激黏附因子和细胞因子的产生，促进动脉粥样硬化的发生和发展，导致血栓形成和心血管事件的发生。因此Lp-PLA2可作为心血管疾病中一种新的炎症酶，是心血管疾病(CVD)、冠心病(CHD)、以及缺血性脑卒中的独立危险因素。检测人外周血Lp-PLA₂浓度能给临床医生提供预防和治疗心脑血管疾病的新靶点，为临床疾病的早期干预、临床应用治疗提供新思路新方向。

目前用于检测Lp-PLA₂的主要方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、免疫比浊法。酶联免疫吸附法具有检测精确度高、灵敏度好等优势，但该方法自动化程度不高，操作繁琐，检测时间长，受人为因素影响较大，结果重复性差，且样本只能批量检测，不能满足医院对该检测指标的时效性、可重复性、及操作简单等特异性方面的需求。化学发光免疫分析法(CLIA)是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体，这种激发态的中间体回到稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接测定Lp-PLA₂的浓度。此法存在吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺直接标记抗体的发光效率低，标记物不稳定等问题，因这种直接标记法属于瞬间发光型，所以很难保证测试结果的稳定性和重复性，且需要特殊的检测仪器，不便于临床应用。胶乳增强免疫比浊法是一种灵敏、简洁、快速的检测方法，但受血脂浓度的影响较大，而心血管病人有很大一部分都存在血脂浓度高的情况，容易产生假阳性。另外抗凝剂的使用，血清中的类风湿因子对该方法的影响也比较大。

采用分光光度法测定Lp-PLA₂活性的原理有两种：一是使用PAF硫酯类为底物，LP-PLA₂水解底物后释放出游离硫醇，然后加入可以检测的硫醇的5，5-二硫(二硝苯甲酸)，在405nm处检测吸光度的变化，来测定LP-PLA₂的活性。此方法的优点是底物可以自己合成或者从市场上购买，来源方便，但该反应易受巯基基团的影响。二是以sn-2位带有4-硝基苯酚基团的PAF类似物为底物，LP-PLA₂水解底物后释放出带有4-硝基苯酚基团的物质，该物质不稳定，在水溶液中马上降解生成对硝基苯酚，试剂吸光度的升高速率与Lp-PLA₂活性成正比，可通过检测405nm波长下吸光度的升高速率求得样本中Lp-PLA₂的活性。该反应受到外界的影响较少且操作简单，可以上全自动生化分析仪。但该方法也存在灵敏度和准确性低的问题。主要是底物在水中的水解度直接影响其水解效率和吸光度变化。PAF类似物为脂类，在水中的溶解度有限，另外样本中血清酶也能水解PAF类似物，影响测定结果。

发明内容

本发明针对现有分光光度计法测定Lp-PLA₂活性的不足，提供一种Lp-PLA₂测定试剂盒及其检测方法，该试剂盒制备成本低廉、灵敏度高、检测方法简单、能够在全自动生化分析仪上迅速检测。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：