[发明专利]Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种建立Ifit3‑eKO1基因敲除小鼠模型的方法，属于生物技术领域，所述的方法包括以下步骤：步骤一、确定Ifit3‑eKO1小鼠待敲除基因的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA；步骤二、将有活性的sgRNA和Cas9RNA显微注射入小鼠受精卵中，获得Ifit3‑eKO1基因敲除小鼠。其优点表现在：本发明使用CRISPR/Cas9基因敲除技术，首次建立了Ifit3‑eKO1基因敲除的小鼠动物模型，为研究Ifit3在肿瘤发生、发展中的作用提供便捷、可靠、经济的动物模型。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用。

背景技术

Ifit3基因，又称为RIG-G基因(维甲酸诱导基因G，retinoic acid.induced geneG)是从急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)细胞系NB4中克隆到的一个可以被全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)诱导表达的基因，位于10号染色体q24，编码一个含490个氨基酸残基的蛋白质，分子量约为60000。

尽管Ifit3最初是由急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4中克隆得到的，但生物信息学分析表明Ifit3是干扰素诱导基因家族中的一员。有研究报道，Ifit3除了在NB4细胞中能够被ATRA显著诱导表达以外，还能在多种肿瘤细胞中被干扰素快速的诱导表达，包括NB4，HL-60、U937等髓系白血病细胞系以及宫颈癌细胞系Hela、非小细胞肺癌细胞系H460、A549和头颈鳞状癌细胞等实体瘤细胞。目前，有关基因功能研究最直接有效的方法是建立转基因和(或)基因敲除动物模型。

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)技术是基于对细菌和古细菌中的免疫系统改造而建立，通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行目标DNA序列识别并造成DNA双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而对目标位点实现基因的定点敲除、敲入以及基因修正等多种修饰。

由于其具有特异性高，分子构建简单，流程短的特点，近年来CRISPR/Cas9技术获得了快速发展。使用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除需要两个关键因素，首先是有效的sgRNA引导序列，再就是Cas9蛋白的存在。与锌指核酸酶(ZFN)技术和类转录样效应因子核酸酶(TALEN)技术相比，因其靶向编辑目标基因的特异性、高效性和设计的简便性等诸多优点得到越来越广泛的应用，在细菌、哺乳动物细胞以及斑马鱼、小鼠、大鼠等都表现出很强的基因组编辑活性。

因此本研究通过CRISPR/Cas9技术通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和sgRNA构建稳定敲除Ifit3-eKO1基因小鼠模型，为进一步研究Ifit3的功能奠定了良好的基础。

中国专利文献CN107043787A公开了一种基于CRISPR/Cas9获得MARF1定点突变小鼠模型的构建方法。中国专利文献CN104293831A公开了一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立高血压小鼠模型的方法。中国专利文献CN105950639A公开了一种金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备方法及其在构建基因修饰小鼠模型中的应用。中国专利文献CN106172238A公开了一种利用Crispr/cas9基因敲除技术建立miR-124基因敲除小鼠动物模型的方法。但是关于Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法。

本发明的第二个目的是，提供一种Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法的应用。

本发明的第三个目的是，提供一种敲除Ifit3-eKO1基因的细胞。