[发明专利]一步法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测人miR-1290的试剂盒

说明书

本发明为一种实时荧光定量RT‑PCR检测人miR‑1290试剂盒，该试剂盒以总mRNA为模板，使反转录和实时荧光定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需打开管盖，避免了交叉污染，并可以精确定量检测标本中人miR‑1290的表达量。该试剂盒可以用于临床及科研中检测患者外周血标本中miR‑1290的表达，用以结直肠癌辅助诊断、指导治疗、复发及提示预后。

技术领域

本发明属生物技术领域，为一种通过以mRNA为模板，使反转录和实时荧光定量PCR在同一反应体系中进行的检测技术，可以精确定量检测标本中人miR-1290 的表达量的试剂盒。

背景技术

上世纪中期，随着人们生存居住环境、饮食习惯以及生活水平的不断改变、不断提高，与此同时各类肿瘤的发病率/死亡率也呈逐年上升趋势。结直肠癌的发病率和死亡率仅次于肺癌和乳腺癌，已成为第三恶性肿瘤。结直肠癌具有高度恶性与侵袭性的生物学特性，常发生浸润、转移，此生物学特性是导致患者预后较差及死亡率较高的一个重要因素。结直肠癌的发生、发展是与多基因相关、多因素相互影响、多步骤、错综复杂循序渐进的过程；然而其诊治关键要点与大多数肿瘤一样，在于早期发现、早期诊断、早期治疗。临床研究表明，早期结直肠癌的手术治愈率可以达到 80%-90%，然而结直肠癌患者常常因早期缺乏特异性的临床症状与体征，不易引起患者足够的重视，难以在患病早期及时的发现并行手术治疗。多数结直肠癌患者在发现时已是中期，甚至是晚期，即使行手术治疗，也难以达到患者理想的效果，术后复发转移率较高，生存期也较短，预后不佳。近几年，以消化道内镜结合病理学检查为主的诊断方法在临床上广泛应用，但是针对我国目前医疗现状来说，暂不适合大规模消化内窥镜筛查，进而导致早期行手术治疗率较低。临床发现中晚期结直肠癌患者即使进行手术治疗，也有 30%-40%的患者术后出现复发或转移播散，复发和转移目前导致结直肠癌患者死亡最主要原因之一。近年来，结直肠癌治疗及手术方案有了明显的改善与进步，同时各种后期治疗手段如：放、化疗在不断更新与完善，生物治疗、基因治疗等新方法不断涌现。血循环中存活的肿瘤细胞是远处转移和复发的基础，尽管各种结直肠癌的各种检测方法不断的增多，然而这一类细胞数量极微，不易被临床常规手段检测出来。近年来，通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 技术检测外周血中微量循环肿瘤细胞(Circulatingtumor cell，CTC) 已成为可能并被尝试。

microRNA (extracellular microRNA)是一类长度约为 21 个核苷酸的非编码小分子RNA，主要参与调控个体发育、细胞增殖和分化等生命活动。研究发现肿瘤患者 miRNA异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关。miRNA 的异常表达可反映肿瘤的存在及生长，是潜在的肿瘤标志物。不仅在肿瘤组织中存在 miRNA的异常表达，而且在外周血中也存在异常表达。此外，有研究者对结直肠肿瘤患者和健康对照组中血清样本miRNA进行全面综合分析，发现miR-1290在结直肠腺瘤和癌症患者血清中高表达，miR-1290在血清和组织中的高表达与肿瘤浸润和不良预后显著相关。血清miR-1290是结直肠肿瘤早期诊断、复发和预后的新型生物标志物。miR-1290与结直肠癌患者的肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移密切关联。因此检测结直肠癌患者外周血等标本中有无miR-1290的表达，可以对上皮类来源的结直肠癌肿瘤的转移诊断和治疗提供有力证据，还可以对肿瘤的转移和复发情况以及疗效观察提供帮助。一步法荧光定量PCR技术使反转录和PCR扩增在同一反应体系中进行，反应过程中无需打开管盖，避免交叉污染，节省实验时间。具有方便、便捷、重复性好等特点。

发明内容

本发明试剂盒包含：逆转录聚合酶链反应液 (RT-PCR反应液)、莫洛尼氏鼠白血病病毒 (M-MuLV) 逆转录酶、RNA酶抑制剂 (Rnasin)、耐热性DNA聚合酶 (Taq DNA聚合酶)、标准品、阴阳性对照品。

其中逆转录聚合酶链反应液含有焦炭酸二乙酯处理的水、逆转录聚合酶链缓冲液、寡聚(dT)_15-18(Oligo(dT)_15-18)、dNTPs、MgCl₂、检测用上下游引物、荧光探针。