[发明专利]一种利用双水相体系萃取木瓜蛋白酶的方法

说明书

本发明公开了一种利用双水相体系萃取木瓜蛋白酶的方法，属于生化分离技术领域。特别涉及用离子液体辅助聚乙二醇/磷酸二氢钠体系，具体包括：以咪唑类离子液体为辅助，加入到按照一定质量分数配制的聚乙二醇400/磷酸二氢钠双水相体系中，然后加入一定浓度的木瓜蛋白酶溶液，配制完成后放在涡旋震荡器上震荡5min混匀，随后放入25℃的恒温水浴锅中静置24h。待分相完成后，分别取上相和下相，用蒸馏水稀释至一定的浓度，测定每一相中木瓜蛋白酶的浓度。本发明能够显著提高聚合物/盐双水相体系萃取木瓜蛋白酶的萃取率，除此之外，还可以降低双水相体系的粘度，低能耗，操作简单等特点。

技术领域

本发明属于生化分离技术领域，涉及一种利用双水相体系萃取木瓜蛋白酶的方法，尤其涉及用离子液体辅助聚合物/无机盐双水相体系萃取木瓜蛋白酶的方法。

背景技术

蛋白质是对生命活动至关重要的一类生物大分子物质，各种生命功能、生命现象、生命活动都和蛋白质有关。在生命有机体催化、运动、结构识别和调节等许多方面，起着关键的作用，其参与了细胞生命活动的每一个进程。因此，蛋白质被广泛的应用于医药、食品、添加剂和化妆品等行业，其需求量越来越大，质量要求越来越高，品种变换越来越快，生产工艺改革越来越新。由此可见，对蛋白质的定性定量分析显得尤其重要，这将会推动蛋白质工业化的进程。但是，首先得解决蛋白质的分离纯化问题。传统的蛋白质分离纯化方法主要有：凝胶层析，超滤凝胶层析，透析，等电点法，溶剂法，反胶团萃取，盐溶法及盐析法，高效液相分离技术法等等。虽然这几种方法能使目标蛋白质在一定程度上实现粗分离，但还存在诸多缺点，如操作步骤比较繁琐、分离过程中容易发生蛋白变性、提取率低、而且纯度不高，限制了产品应用范围的扩大。木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类巯基蛋白酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内,其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。它具有较强的蛋白酶水解和合成能力,还具有凝乳、解脂和溶菌活力。木瓜蛋白酶是一种从木瓜乳液中得到的内分解半胱氨酸蛋白酶，它可以催化水解蛋白质和肽键中的碱性氨基酸，如精氨酸或赖氨酸。作为最广泛使用的工业用酶之一，木瓜蛋白酶已被应用于细胞分离，洗涤剂，皮革，纺织品，医学，化妆品，食品和制药工业。由于此酶为纯天然产物,其开发前景越来越受到人们的重视。一些研究已经报道用经典的双水相体系萃取木瓜蛋白酶。

双水相萃取技术是一种新型的液液萃取技术，与传统的萃取技术相比，因其体积小、处理能力强、分相时间短、适合大规模化生产等特点，被广泛应用于物质的萃取、分离和纯化。双水相体系萃取虽然有上述诸多优势，但是双水相萃取蛋白的主要问题是聚合物粘度高，不利于目标分子的反萃取。近年来兴起的离子液体成为一个新的亮点。离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的，一般由含氮、磷的有机阳离子和无机阴离子所组成，也称为室温熔融盐(熔点一般100℃)。离子液体(Ionic Liquid)具有液态范围宽、熔点低、蒸汽压小、不易挥发、电化学窗口大、酸性可调、粘度低和密度大，可以形成双水相等特点。改变阴阳离子的结构，可以合成具有特定性质的离子液体，即是“可设计的”，以达到相应的应用目的。离子液体(IL)与传统有机溶剂相比，突出的特殊性质和表现使其获得了“绿色溶剂”的称号，在电化学、溶剂萃取、有机反应、高分子合成、分离纯化和生物传感器等多个领域得到了广泛的研究与应用。因而受到越来越多研究者的关注。但是离子液体一般都比较昂贵，对食品还是有一定的污染和毒害作用，在萃取蛋白的体系中，想要回收离子液体比较困难。