[发明专利]长效重组猪FSH融合蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了两种长效重组猪FSH融合蛋白，包括pFSH‑Fc‑1和pFSH‑Fc‑2，其α亚基/β亚基直接或间接通过连接元件融合至Fc片段上，β亚基/α亚基通过范德华力或连接元件与α亚基/β亚基结合。所述猪FSH融合蛋白可基于基因工程技术，利用真核表达系统制备得到。两种猪FSH融合蛋白药效好，比天然猪FSH半衰期长；又不会对动物产生不良效应，可替代孕马血清促性腺激素(PMSG)在动物繁殖生产中的使用。本发明还涉及两种猪FSH融合蛋白在制备动物繁殖领域药物中的用途。

技术领域

本发明涉及生物医药和动物繁殖技术领域，具体地说，涉及一种长效重组猪FSH融合蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

猪促卵泡素(Porcine Follicle-stimulating hormone，简称pFSH)是一种猪垂体前叶分泌的促性腺激素，由一个α亚基和一个β亚基非共价连接，其中α亚基高度保守，与猪促黄体素(Porcine Luteinizing Hormone,pLH)、猪促甲状腺素(Porcine ThyroidStimulating Hormone,pTSH)的α亚基完全相同；β亚基存在差异，主要决定FSH的功能特异性。pFSH可以促进母猪子宫内膜、卵巢和卵泡的生长和成熟；促进雌激素的合成与分泌；诱导公猪曲细精管的发育和维持精子生成。pFSH在动物繁殖领域中常用于同期发情、超数排卵、胚胎移植、母畜卵巢疾病的治疗。有研究表明猪FSH用于牛、羊的超排效果要好于牛羊自身的FSH，因此pFSH对畜牧生产和经济动物繁殖具有重要价值。

目前已有相关专利和文章报道了FSH融合蛋白的表达，但大部分是关于人FSH的重组表达与应用，将人FSH用于动物繁殖领域，也获得了一些成功。然而尽管人与家畜同属于哺乳动物，但在蛋白序列上仍存在较大的种属差异(人和猪FSHα亚基氨基酸序列同源性为73％，β亚基同源性为93％，Fc片段同源性为73％)。如果长期将人重组FSH用于动物上，会被动物的免疫系统识别诱生抗体(包括中和抗体)，这些抗体特异性结合动物FSH的受体结合位点，从而阻断药物的生物学活性，导致人FSH在动物体内的生物利用度越来越低，限制了人FSH在动物，尤其是需要长期使用FSH的猪、牛、羊等经济动物上的应用，这也是目前市售的人重组FSH不用于动物繁殖领域的原因之一。

目前市面上畜用FSH产品主要包括猪垂体提取的FSH和孕马血清促性腺激素(PMSG)。猪垂体FSH，如Folltropin-V(加拿大)，半衰期短(5h)，需要频繁给药，导致终端客户给养和管理成本高；并且从猪垂体组织中提纯时很难将猪FSH与LH分离、纯化难度大、产能低，所以在实际应用中受到很大限制。PMSG是一种马属动物胎盘尿囊绒毛膜细胞分泌的糖蛋白激素，兼具FSH(高)和LH(低)活性，具有促进动物卵巢和睾丸生殖机能的作用。在动物繁殖领域，常用于诱发雌性动物同期发情、超数排卵，治疗雌性动物繁殖障碍和卵巢功能不全；促进雄性动物曲细精管发育和精子生成。但因PMSG分子含有较高的己糖和唾液酸，在动物体内半衰期太长(120h)，用于动物超数排卵时，容易引发母畜的多种不良效应，如卵巢囊肿，妊娠初期胚胎的提前退化；并且商品化的PMSG从孕马血清中提取纯化，用于其它动物时会产生抗体，存在一定的免疫原性，不能长时间使用。此外，从怀孕母马采集血清制备PMSG，经常因采血过多导致母马流产、胎马死亡，不符合动物伦理。

因此基于人FSH不适用于动物、猪垂体FSH需要频繁给药、PMSG易产生不良效应，动物繁殖领域特别是经济动物需要长效的动物源FSH。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的长效重组猪FSH融合蛋白及其制备方法与应用。

本发明的构思如下：Fc融合蛋白技术是蛋白药物长效化研发中最广泛使用且最稳定的技术之一，利用基因工程技术将FSH与Fc融合产生新型重组蛋白FSH-Fc。不仅能保留FSH的高生物活性，还可以获得较长的半衰期；同时得到的重组蛋白纯度高，质量相对均一，不含有LH，安全系数高。使用哺乳动物表达体系，尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达重组蛋白，能获得在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然的蛋白分子。