[发明专利]实时荧光PCR技术筛查白血病MLL-SEPT6融合基因的引物、探针和方法

说明书

本发明公开了利用荧光定量PCR技术检测MLL‑SEPT6融合基因相对表达量的方法，包括特异性的引物和探针，可作为筛查白血病患者体内MLL‑SEPT6融合基因微量残留，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

技术领域

本发明属生物技术检测领域，特别涉及一种筛查融合基因的方法，采用探针Taqman实时荧光PCR技术检测人类白血病患者体内MLL-SEPT6融合基因的情况。

背景技术

白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。关于人类白血病的病因与发病机理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、电离辐射、化学物质，遗传因素及免疫功能异常等。目前认为白血病病因是以上各种因素相互作用的结果。

人类MLL(mixed-lineage leukemia or myeloidlymphoid leukemia)基因，又称HRX、HTRX1、ALL-1或TRX1基因，位于11号染色体长臂2区3带(11q23)，共36个外显子。MLL基因是造血过程调控的一个关键基因，其异常与白血病的发病密切相关。MLL基因与SEPT6基因发生易位重排，形成融合蛋白。SEPT6是MLL基因的融合伴侣之一，多见于婴儿型白血病。SEPT6基因位于X染色体长臂2区4带(Xq24)，有11个外显子。MLL-SEPT6融合基因目前发现五种融合形式：MLL exon7-SEPT6 exon2、MLL exon8-SEPT6 exon2、MLL exon9-SEPT6 exon2、MLL exon10-SEPT6 exon2和MLL exon11-SEPT6 exon2。目前报道病例数最多的为：MLLexon9-SEPT6 exon2、MLL exon10-SEPT6 exon2和MLL exon11-SEPT6 exon2三种融合形式。

在实际应用中，用于筛查MLL-SEPT6融合基因的方法主要有染色体核型分析，多重巢式PCR联合电泳法等方法。染色体核型分析通过肉眼观察判断，需对样本中的有核细胞进行培养，具有核分裂相才能进行观察；而细胞培养增殖过程中，会出现某类细胞优势生长，“淹没”病变细胞的可能，造成染色体核型正常的假象。其次，有些病例染色体的易位复杂且微小，无法靠肉眼观察进行分析。再者，染色体核型分析无法满足MRD(Minimal ResidualDisease,微小残留病灶)检测的需求。而多重巢式PCR联合电泳的方法耗时长，过程繁琐，易污染，结果的判断较主观，且PCR反应体系多，成本高，不适用于高通量的样本检测。只能进行定性检测，不能同时满足灵敏度高和特异性好的需求。因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对MLL-SEPT6融合基因的mRNA残留进行筛查。

发明内容

本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用实时荧光PCR技术，筛查MLL-SEPT6融合基因。该方法快速准确，灵敏度高，特异性好，检测通量大。

用于MLL-SEPT6基因的检验试剂中包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra AceqPCR RT Kit(TOYOBO公司)、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。

检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX(TOYOBO，QPS-101)、检测目的基因用上下游引物分别为：MLL(exon9)-F、MLL(exon10)-F、MLL(exon11)-F，SEPT6(exon2)-R探针为MLL-SEPT6-Probe，检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针为abl-Probe。其中，

MLL(exon9)-F:GAACATCCTCAGCACTCTCTCC