[发明专利]一种兽用复合免疫佐剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及兽医免疫学和生物制药领域，具体是一种兽用复合免疫佐剂及其制备方法和应用。

背景技术

自1798年英国医生琴纳(Jenner) 创立应用牛痘脓疱制成疫苗预防天花以来，疫苗的研究和应用已经有了200多年的历史, 其间经历了经典减毒疫苗、细胞疫苗、分子水平疫苗的发展历程。无论是以感染组织或鸡胚的胚液制备的疫苗还是以人工感染的细胞培养物制成的疫苗, 都曾经也正在对预防人类和动物传染病发挥重要作用。1925年，法国免疫学家拉蒙（Gaston Ramon）首次发现在疫苗中加入某些物质可以特异性地增强机体的免疫应答反应，从而拉开了使用佐剂的序幕。佐剂（Adjuvants）是一种非特异性免疫增强剂，临床上常在疫苗免疫前单独加入或与疫苗混合注入动物体内，用以增强动物机体对抗原或免疫原的免疫应答反应或改变其免疫应答类型，特别是在再次免疫应答中，其增强作用更加明显。实践证明，疫苗与佐剂的联合应用，不仅可以显著提高疫苗的免疫效果，还可以减轻动物机体的免疫耐受。常用的佐剂主要有不溶性铝盐类胶体、油水乳剂、微生物及其代谢产物、核酸及其类似物、细胞因子、免疫刺激复合物、蜂胶、脂质体等。

不同类型的佐剂作用方式不同，如弗氏完全佐剂主要在抗原递呈过程中起作用，而佐剂中含糖(如皂苷)或其他碳水化合物则会增加免疫原传递到巨噬细胞和DC的数量。总的来说，免疫佐剂主要通过免疫调节、参与抗原递呈、诱导CD8+细胞应答、抗原贮存等方式发挥作用。

理想的免疫佐剂应符合以下几条标准: ①无致癌性，无毒副作用；②用于食用动物不应有药物残留；③能促进抗原引起体液和细胞免疫；④能以不同途径免疫，也能用于不同抗原；⑤在动物体内能被降解吸收；⑥不含与动物有交叉反应的抗原物质；⑦不应诱发自身超敏反应；⑧使用稳定，正常条件下不易分解和变质。

现有研究表明，将多种不同作用机制的佐剂联合起来应用，能有效激活复杂有序的天然免疫系统并产生预想的获得性免疫应答。如弗氏不完全佐剂 (IFA )与纯化的皂苷成分 (QS21)、 IL- 12 等可溶性 、有佐剂活性的分子联用对低免疫原性及需要 Thl型应答的抗原很有价值；以皂苷 、单磷酸脂质 A (MPL)和分枝杆菌细胞壁混合而成的RiBiDetox水包油佐剂与H IV-1疫苗共用时，可诱导较强的Th l型应答（Jensen FC等，1998）。

基于此，本发明选用三种临床经常使用的佐剂作为原料，通过临床免疫增强试验，旨在筛选出一种安全、高效的复合免疫佐剂。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种兽用复合免疫佐剂及其制备方法和应用，这种兽用复合免疫佐剂具有安全性高、高效多能的特点。

实现本发明目的的技术方案是：

一种兽用复合免疫佐剂，由下述重量配比的原料制成：

胞壁酰二肽37.5-150mg/mL；

盐酸左旋咪唑7.5-67.5 mg/mL；

刀豆素25-225 mg/mL。

优选地，兽用复合免疫佐剂由以下重量配比的原料制成：

胞壁酰二肽150 mg/mL；

盐酸左旋咪唑7.5 mg/mL；

刀豆素25 mg/mL。

上述兽用复合免疫佐剂的制备方法，按照上述原料的重量配比取各原料混入含有抗原的水相，再取油相，按照体积比水相:油相=1:2乳化，制备成含有兽用复合免疫佐剂的灭活疫苗。

制得的灭活疫苗，给小鼠肌肉注射100μL /只，14天后二免。

确定上述兽用复合免疫佐剂最佳组分含量的方法，包括以下步骤：

（1）确定三种制剂组分：胞壁酰二肽、盐酸左旋咪唑和刀豆素；

（2）设计如表一所示的三种组分的三种不同注射剂量：

表一：三种组分的三种不同注射剂量

（3）进行不同剂量单组分的小鼠免疫试验，得到不同剂量的小鼠血清细胞因子浓度以及特异性抗体水平；

（4）根据步骤（3）的小鼠血清细胞因子浓度以及特异性抗体水平，结合最终的攻毒保护率，综合这几项指标，得出高剂量的胞壁酰二肽无论在细胞因子分泌水平或是抗体生成水平上都均比同组的其他剂量效果显著，而低剂量的盐酸左旋咪唑和刀豆素效果更佳，因此选择①组（左低+刀低），②组（左低+胞高）， 组（刀低+胞高）和组（刀低+左低+胞高）组成复方进行下一步的免疫试验，其中胞高为高剂量胞壁酰二肽，左低为低剂量盐酸左旋咪唑，刀低为低剂量刀豆素；