[发明专利]一种氯化藻类有机质及其制备方法和毒性分析方法

说明书

本发明公开了一种氯化藻类有机质溶液、及其制备方法和毒性分析方法。本发明的氯化藻类有机质溶液是通过先采用氮气吹干的方法获得小球藻藻体，液氮研磨后复溶，保持溶液总有机碳含量为40～60mg/L，氯化，并以碱性溶液进行中和，制备了一种稳定的Cl‑AOM溶液，本发明的Cl‑AOM毒性分析是通过PCR技术检测Cl‑AOM暴露caco‑2细胞后其P450系统中CYP1A1和CYP1B1的表达量来实现的，其在Cl‑AOM混合溶液水平直接进行毒性检测，大大节省了时间。此外，PCR技术能够检测到微量的基因表达差异，具有检测限低、准确度高和灵敏度好的特点，能够对痕量毒性物质引起的基因表达差异进行检测。

技术领域

本发明属于检测技术领域，更具体的，本发明涉及一种氯化藻类有机质及其制备方法和毒性分析方法。

背景技术

水体中的藻类(小球藻)过度繁殖会导致水体中有机质的增加，这些有机质经自来水厂氯化消毒后会产生成百上千种消毒副产物(Disinfectionbyproducts，DBPs)，如氯仿、三氯甲烷和氯乙腈等。目前已有大量关于单种DBPs毒性分析的报道，但氯化藻类有机质(chlorinated algae organic matter，Cl-AOM)的制备及毒性研究尚鲜有报道，Cl-AOM经消化系统进入人体，其毒性是其含有的各种DBPs及其它毒性物质综合作用的结果，因此，基于Cl-AOM进行毒性检测具有重要的现实意义。

人源细胞由于来源于人体组织，具有良好的代表性，Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，与分化的小肠上皮细胞具有类似的结构和功能，是Cl-AOM毒性分析的首选细胞模型。Caco-2细胞具有细胞色素P450系统，细胞色素P450系统的酶系是人体细胞催化代谢外来物质的主要酶系，能够通过氧化反应消除或减弱部分外来物质的毒性。毒性物质作用于细胞后，会刺激基因mRNA的表达，随之P450蛋白合成增加，表现在酶活的增加。P450系统中的酶能催化7-乙氧基异吩恶唑酮生产异吩恶唑，通过检测异吩恶唑的荧光活性，能反应P450酶的活性，进而检测物质的毒性。

目前，已有通过细胞色素P450系统酶活进行毒理学研究的报道，常见的是使用7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶(EROD)活性进行检测。如许友卿等在发明专利CN106093332A中公开了利用鱼的EROD检测水体污染的方法，徐镜波等通过鱼肝微粒体EROD活性对9种硝基苯的毒性进行了报道，刘芸等在发明专利CN102520154A中公开发明了一种通过检测大鼠肝细胞瘤H4ⅡE细胞EROD酶活性检测环境中二恶英类物质的方法，江艳艳等(1980)用苯并[α]芘对人胎盘绒毛膜上皮细胞进行诱导，通过EROD活性检测发现细胞色素P4501A1的活性明显增加，陈曦等(2011)用DEHP和B(a)P联合染毒诱导HepG2细胞，发现细胞的CYP1A1在基因、蛋白和酶活性水平均具有一定程度的变化。

国内外对于Cl-AOM的相关污染物的毒性常采用动物的EROD实验进行检测。然而，动物的P450酶与相对应的哺乳动物的酶在底物专一性上有很大差别，不能反映出物质的人体毒性情况。此外，EROD实验操作繁琐，结果精确度不高，不同实验存在一定的差别。人源细胞模型是模拟人体、检测毒性的理想模型，但如何选择检测靶点是目前应用细胞模型进行Cl-AOM毒性分析的难点。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种氯化藻类有机质及其制备方法和毒性分析方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种氯化藻类有机质溶液的制备方法，包括以下步骤：

(1)、使用BG11培养基培养小球藻后，离心干燥，得到藻粉；

(2)、使用缓冲液溶解藻粉，调节溶液的有机碳含量为40～60mg/L，离心，取上清液过0.45um滤膜；