[发明专利]菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及应用

说明书

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域，旨在提供一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT‑SPI基因及应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由该基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。由该基因体外原核表达获得的重组蛋白能够有效抑制其寄主小菜蛾血淋巴酚氧化酶原的激活，从而抑制寄主血淋巴的黑化作用，减弱寄主的免疫反应，为获得新型转基因抗虫作物提供了序列参考。该重组蛋白能够抑制枯草杆菌蛋白酶A，胰蛋白酶和猪胰腺弹性蛋白酶的活性，对于开发丝氨酸蛋白酶抑制剂类药物具有重要的意义。本发明能够在较短的时间内获得大量的可溶性CvT‑SPI重组蛋白，为进行CvT‑SPI的活性实验提供了便利。

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞中表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及其编码的核酸序列和潜在应用价值。

背景技术

丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类分布广泛于植物、动物、微生物等中，是丝氨酸蛋白酶活性的调节剂。根据其序列的同源性、半光氨酸残基和分子中二硫键的数目，丝氨酸蛋白酶抑制剂可分为Kunitz、Kazal、Bowman-Birk、Serpin、TIL(Trypsin Inhibitor LikeCysteine Rich Domain)等几个家族。丝氨酸蛋白酶抑制剂参与生物体内一系列的生理和病理过程的调控，如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等发挥着关键性的调控作用，从而维持生命体内稳态。丝氨酸蛋白酶抑制剂在在医学上具有很好的应用价值，丝氨酸蛋白酶抑制在临床上用于胃炎、胰腺炎等疾病的治疗已有报道。

害虫一直严重危害着农作物的安全生产，给粮食生产带来了严重的损失，而长期以来害虫的防治主要依赖于化学农药，其后果是导致害虫再猖獗、害虫产生抗药性、农药残留以及环境污染等，迫切需要新的安全、高效、低毒的防治方法。随着转基因技术的发展，提供了一种新的害虫防治的新方法。菜蛾盘绒茧蜂(Cotesiavestalis)是防治小菜蛾(Plutellaxylostella)的主要优势寄生性天敌，寄生蜂利用多种寄生因子如毒液、多分DNA病毒、类病毒颗粒、畸形细胞等寄生因子破坏寄主免疫反应，调控寄主生长发育等以保证其后代在寄主血腔或者体表正常发育。畸形细胞(Teratocytes)是菜蛾盘绒茧蜂卵在寄主体内发育过程中由蜂卵的浆膜层解离下来的一种特殊细胞，畸形细胞能够分泌一些功能蛋白，其中也包括一些胞外丝氨酸蛋白酶抑制剂。将寄生蜂的寄生因子的基因结合转基因生物技术，有望用于获得新型转基因抗虫作物，为鳞翅目害虫生物防治开辟新的途径。目前，将红足侧沟茧蜂(Microplitisdemolitor)畸形细胞的分泌蛋白转入烟草，并使烟草天蛾(Manducasexta)生长明显缓慢，危害程度明显低于非转基因对照，使烟草具有抗虫性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及应用。

为解决技术问题，本发明的解决方案如下：

提供一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步提供了由前述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步提供了由前述基因编码的蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有95％～100％同源性，是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过增加、缺失或者替换一个或者多个氨基酸且具有同等活性的衍生蛋白。

本发明进一步提供了由前述蛋白制得的重组蛋白，是将所述蛋白去除信号肽(1-22aa)前体后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明中，所述重组蛋白的制备方法包括：将去除信号肽的序列用于构建原核表达载体，在蛋白的C-末端加上His-tag，并利用His-tag纯化重组蛋白。