[发明专利]端粒酶催化亚基全基因过表达腺病毒重组载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体而言，涉及用于基因治疗的腺病毒重组载体，该腺 病毒重组载体能够阻断慢性应激导致的成年海马神经元发生低下，治疗慢性应激导致的 抑郁症。

背景技术

端粒酶是一种自身携带模板的逆转录酶，能够催化DNA末端的端粒合成，其组成包 括端粒酶催化亚基(TERT)、端粒酶相关蛋白(TR)和端粒酶RNA组分(TERC)。 端粒酶主要在干细胞中存在，在神经干细胞中大量表达。随着细胞的发育分化成熟，细 胞中的端粒酶含量逐渐下降直至消失。但是，在成年脑中仍然有两个神经干细胞池，包 括海马的颗粒细胞下层和侧脑室的室管膜下层。这两部位的神经干细胞被称之为成年干 细胞，这些成年干细胞每天都在分裂增殖，产生大量的新生的神经元。这些神经元经过 分化、发育为成熟的神经元和胶质细胞融入到已有的神经环路中发挥功能。海马成年干 细胞表达大量的端粒酶，参与海马成年干细胞的增殖、分化等过程。实验证实海马端粒 酶缺乏会导致海马成年干细胞的增殖能力下降、发育为神经元的比例下降。

目前，尚没有文献报道过端粒酶过表达在治疗抑郁症方面的应用。

发明内容

本发明人在前期的研究中发现，慢性应激可以导致成年海马中的端粒酶表达和活性 下降，通过降低神经元发生诱导抑郁行为。

既然成年海马端粒酶功能下降与抑郁行为相关，因此本发明人创造性地探索了过表 达海马中的端粒酶催化亚基能否逆转或者预防抑郁行为，结果意外地发现海马TERT过 表达后具有抗抑郁作用。

基于以上研究成果，本发明目的之一是提供提高细胞端粒酶活性的方法；

本发明目的之二是提供Ad-mTERT-GFP腺病毒重组载体；

本发明目的之三是提供构建Ad-mTERT-GFP腺病毒重组载体的高效方法；

本发明目的之四是验证Ad-mTERT-GFP腺病毒重组载体在抑郁症中的治疗作用；

本发明目的之五是阐明Ad-mTERT-GFP腺病毒重组载体抗抑郁作用的途径。

本发明的第一方面，提供了一种提高细胞端粒酶活性的方法。通过过小鼠端粒酶催 化亚基的表达增加端粒酶活性。其主要设计是将小鼠的mTERT的全长基因导入到重组 腺病毒载体中(Ad-mTERT)，并连接报告基因GFP。通过腺病毒重组载体感染目的细 胞后就可以过表达小鼠的端粒酶催化亚基TERT。这种过表达的原理是：(1)TERT是 端粒酶的核心功能区；(2)表达全长的TERT，保证TERT功能的发挥；(3)引入报道 基因GFP，为药物临床前研究和神经生物学的实验研究提供了标签，对细胞和组织不产 生影响。

本发明的第二方面，提供了一种过表达TERT基因的载体工具。该载体按照本发明 第一方面所述提高细胞端粒酶活性的方法思路进行设计。具体地，应用pDC315-GFP载 体，导入TERT基因，用腺病毒包装后具有较高的感染效率和表达效率，不影响TERT 的功能。GFP蛋白具有无毒性和免疫原性的优点，安全性较好。

本发明的第三方面，提供了Ad-mTERT的高效构建方法。首先从胚胎小鼠的海马体 中，利用RT-PCR的方法钓取mTERT基因，然后将目的基因与目的载体(pDC315-EGFP) 分别进行双酶切。纯化酶切产物后进行定向连接或重组，其产物转化用氯化钙制备新鲜 的大肠杆菌感受态细胞，对长出的克隆先进行PCR鉴定，其上下游引物分别设计在载 体和目的基因上(Primer(+):TERE-SEQF:TGAACAGCCTCCAGACAGTC，Primer(-): EGFP-C-R：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG).PCR鉴定为阳性的克隆，证明目的基 因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对，比对正确 的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内 毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明转入293T细胞，36-48h后通 过荧光显微镜观察融合蛋白GFP/RFP，或者通过Western Blot/RT-PCR等检测方法检测 目的基因的表达。

本发明的第四方面，验证特异性过表达mTERT的功能。药效学实验结果显示，用 本发明所述的腺病毒重组载体能够使TERT表达增加、端粒酶活性增加，刺激神经干细 胞增殖、分化、可塑性，改善小鼠抑郁行为，是一种有效的抗抑郁治疗手段。在实验研 究中，该病毒载体能够用于涉及的端粒酶的神经生物学研究，提供一种有效的增加端粒 酶功能的工具。具体药效学试验过程详述如下：