[发明专利]多重扩增子测序用引物系统、其应用以及测序文库的构建方法

权利要求书

1.一种多重扩增子测序用引物系统，其特征在于，包括第一轮反向特异性引物组、第二轮正向特异性引物组、第二轮反向通用引物、第三轮正向测序接头引物和第三轮反向测序接头引物；其中，

所述第一轮反向特异性引物组包括多个不同的第一轮反向特异性引物，每个所述反向特异性引物从5’端至3’端分别为反向接头序列、条形码序列和反向特异性序列，所述第一轮反向特异性引物组中的多个不同的第一轮反向特异性引物的条形码序列不同，且所述第一轮反向特异性引物组中的多个不同的第一轮反向特异性引物的反向特异性序列分别与待测目标区域的不同区段互补；

所述第二轮正向特异性引物组包括多个不同的第二轮正向特异性引物，每个所述第二轮正向特异性引物从5’端至3’端分别为正向接头序列和正向特异性序列，所述第二轮正向特异性引物组中的多个不同的第二轮正向特异性引物的正向特异性序列分别与待测目标区域的不同区段互补；

所述第一轮反向特异性引物组包括序列如SEQ ID No.1~20所示的各引物；

所述第二轮正向特异性引物组包括序列如SEQ ID No.21~40所示的各引物；

所述第二轮反向通用引物的3’端含有所述反向接头序列；

所述第三轮正向测序接头引物的3’端含有所述正向接头序列，所述第三轮反向测序接头引物的3’端含有所述第二轮反向通用引物的序列；

所述第三轮反向测序接头引物的序列中含有索引序列，所述第三轮反向测序接头引物也有多个，各个所述第三轮反向测序接头引物中的所述索引序列不同。

2.如权利要求1所述的多重扩增子测序用引物系统在制备高通量测序的引物试剂中的应用。

3.一种多重扩增子测序文库的构建方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的多重扩增子测序用引物系统，所述多重扩增子测序文库的构建方法包括如下步骤：

用所述第一轮反向特异性引物组对含待测目标区域的模板DNA进行第一轮单引物PCR扩增，第一轮单引物PCR扩增只进行一个循环，之后进行纯化处理，得到多个第一轮产物片段，各个所述第一轮产物片段带有不同的所述条形码序列；

以所述第二轮正向特异性引物组以及3’端含有所述反向接头序列的第二轮反向通用引物对纯化后的第一轮单引物PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增，并对所述第二轮PCR扩增的产物进行纯化处理，得到多重扩增子；

对纯化后的第二轮PCR扩增的产物以3’端含有所述正向接头序列的第三轮正向测序接头引物和3’端含有所述第二轮反向通用引物的序列的第三轮反向测序接头引物进行第三轮PCR扩增，纯化后得到用所述条形码序列标记的目标区域的测序文库。

4.如权利要求3所述的多重扩增子测序文库的构建方法，其特征在于，还包括在所述第一轮单引物PCR扩增之前以及在所述第二轮PCR扩增之前，分别将所述第一轮反向特异性引物组和所述第二轮正向特异性引物组分成多个小组的步骤，每个第一轮反向特异性引物小组含多种不同的第一轮反向特异性引物，且每个第二轮正向特异性引物小组含多种不同的第二轮正向特异性引物组，后续所述第一轮单引物PCR扩增和所述第二轮PCR扩增均分别使用不同小组的引物进行独立扩增，并在进行第三轮PCR扩增之前，将多个小组的第二轮PCR扩增的产物进行混合后再进行第三轮PCR扩增。

5.如权利要求3或4所述的多重扩增子测序文库的构建方法，其特征在于，在对第一轮单引物PCR扩增的产物进行纯化处理时是进行至少两次磁珠纯化；

在对第二轮PCR扩增的产物以及第三轮PCR扩增的产物进行纯化是使用磁珠纯化和筛选。