[发明专利]在透射电镜下观察捕食螨精包的方法

说明书

技术领域

本发明涉及在透射电镜下观察捕食螨精包的方法，属于植绥螨科捕食螨生物学基础研究领域。

背景技术

植绥螨科捕食螨是雌雄异体动物，须经过雌雄螨交配受精后才会产卵繁育后代，后代无论雌雄均从受精卵发育而来。

现有资料对于植绥螨科捕食螨雌雄螨交配形成受精卵的了解是：雄螨精子在进入雌螨体内前储存在精包中，雌螨把精包塞入雌螨交配孔（参考文献：梁来荣，1979年，植物保护，螨类是怎么生活的），精子再从精包慢慢释放出来，转移到受精囊和卵结合，形成受精卵。但对于捕食螨雄螨精子如何进入雌螨体内、及雄螨精子是否存在二态性均没有报道，若要研究解决这一系列问题，首先需要获得精包，对精包进行观察研究。

由于捕食螨个体非常微小只有几百个微米，其精包只有雌雄螨交配时才出现，交配过程中雌雄螨非常紧密的叠合在一起，交配时间也非常短仅有1小时左右，而精包大小仅有十几个微米且隐藏在雌雄螨身体紧密接触的腹面之间，直观上很难看到，现有资料也没有如何获得精包的方法。因此想获得精包十分困难，对精包进行透射电镜观察更困难，需要开拓一种获得捕食螨精包并对精包进行透射电镜观察的方法。

发明内容

本发明的目的是提供在透射电镜下观察植绥螨科捕食螨精包的方法，应用本方法可以了解捕食螨精包内精子的发育过程及精子形态，还可以掌握精包内的超微结构，为明确捕食螨雄螨在性别决定中的作用提供参考。

本发明是从正在交配中的植绥螨科捕食螨雄螨颚体上获得精包后在透射电镜下观察精包的方法，包含交配中雌雄螨的获取、雌雄螨的定型、雌雄螨的分离、精包的获得、精包透射电镜样品制备与观察5部分，具体操作为：

（1）交配中雌雄螨的获取：在显微镜下，从捕食螨饲养种群内，挑出捕食螨的卵单独饲养至成螨后进行雌雄螨配对，配对10分钟左右雌雄螨即可交配，从而获得交配中雌雄螨；

（2）交配中雌雄螨的定型：在捕食螨交配后0-120分钟内，将正处在交配过程中的雌雄个体连同饲养装置一起放置于-80℃超低温冰箱或液氮中3-5分钟，进行雌雄螨定型；

（3）定型后雌雄螨的分离：定型后将捕食螨雌雄螨连同饲养装置一起取出，再在显微镜下，用细毛笔从饲养装置中将交配的雌雄螨挑入载玻片上，再利用0号昆虫针和细毛笔等工具将交配的雌雄螨轻轻分开，防止破坏精包；

（4）精包的获得：雌雄螨成功分开后，在显微镜下，利用手术刀将雄螨的鄂体切下来，保留颚体，在颚体上很容易观察到处于导精趾顶端的精包，然后用细毛笔尖将精包轻挑取下放入70%-100%酒精内保存或直接利用；

（5）精包透射电镜样品制备与观察：

1）固定：将取下的外精包放入浓度为3.5%戊二醛的固定液中，为了使固定效果更好，可向戊二醛中加入吐温80（1L:600mL）和氯化钠（1L:0.9g），固定48小时，然后用浓度为0.1mol/l、PH值为7.2的磷酸缓冲液冲洗（10分钟/次），冲洗3小时，再用锇酸固定2小时，最后用磷酸缓冲液冲洗3-4遍；

2）脱水：先进行梯度脱水，分别放在30%、50%、70%、80%、90%、100%的酒精中进行脱水，每个梯度脱水5分钟，再用丙酮脱水15分钟，4-5次，留少许丙酮溶液；

3）包埋：加入树脂溶液，将样品和树脂充分混合，浸泡12小时，然后将外精包整齐地放入树脂模具中摆正姿态，赶走树脂内气泡；

4）固化：将模具放入35度烤箱中烘烤2-3周；

5）切片：利用超薄切片机切片 50-60nm；

6）染色：用醋酸铀和柠檬酸铅染色1小时左右；

7）观察：在透射电镜下观察拍照。

利用透射电镜可以对捕食螨的外精包的内部结构和物质进行超微观察，通过观察我们可以进一步明确外精包内精子的形态、数量以及精子在到达雌螨体内之前是否发生变化（如：发生异质化）等，这有利于确定捕食螨雄螨在性别决定过程中是否起了决定性的作用。

具体实施方式

实施例 以拟长毛钝绥螨为例，在透射电镜下观察捕食螨精包的方法

本方法是从正在交配中的拟长毛钝绥螨雄螨颚体上获得精包后在透射电镜下观察精包的方法，包含交配中雌雄螨的获取、雌雄螨的定型、雌雄螨的分离、精包的获得、精包透射电镜样品制备与观察5部分，具体操作为：

（1）交配中雌雄螨的获取：在显微镜下，从拟长毛钝绥螨饲养种群内，挑出拟长毛钝绥螨的卵单独饲养至成螨后进行雌雄螨配对，配对10分钟左右雌雄螨即可交配，从而获得交配中雌雄螨；