[发明专利]用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用

说明书

本发明提供了一种用于敲除人ALDH2基因的sgRNA序列，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列中的至少一条。本发明还提供了一种敲除人肝癌细胞ALDH2基因的方法，为利用CRISPR/Cas系统在人肝癌细胞中对ALDH2基因进行改造。本发明还提供了两种ALDH2基因缺失细胞株细胞株，ALDH2参与机体重要的代谢功能，本发明提供的ALDH2基因敲除细胞株为外源性化学物或者外源性毒物在体内的代谢研究提供了有效的平台，对于慢性疾病(如酒精性肝脏疾病及糖尿病)及肿瘤相关疾病的研究提供了有力工具。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种用于敲除人ALDH2基因的gRNA序列、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及其应用。

背景技术

ALDH2是乙醛脱氢酶非常重要的一个亚型，位于人体第12号染色体上(12q24.2)，主要作用是将乙醛氧化成乙酸，其参与酒精的次级代谢产物乙醛在体内的代谢和解毒过程，促进酒精在肝脏中代谢，被认为与亚洲人的酒精代谢及酒精依赖性有密切的关联。

慢病毒系统是目前介导目的序列进入靶细胞的方法之一，是以HIV为基础发展起来的一种方法，它克服了部分病毒系统只能感染分裂期细胞的缺陷，慢病毒系统既可以感染分裂期又可以感染非分裂期细胞，并能将目的基因整合进宿主细胞基因组中，发挥持久而稳定的干扰效应。

有限稀释法挑选单克隆细胞的原理是利用梯度稀释，当稀释梯度足够高时，可以获得的单一细胞，培养增殖之后能获得背景单一的细胞株。有限稀释法的操作简单，容易得到单克隆细胞株。

CRISPR/Cas9系统是一种后天免疫防御系统，用以保护细菌或古细菌免受外来质粒或噬菌体的侵入，这类细菌或古细菌基因组的CRISPR序列能表达与入侵者基因组序列相识别的RNA，在CRISPR相关酶(CAS9)的作用下切割外源基因组DNA，达到抵制入侵的目的，经过人为改造后，CRISPR/Cas9系统可以实现在真核细胞中高度灵活且特异的基因组编辑，是目前基因组编辑领域最受欢迎的新一代基因组编辑技术，目前该技术已被用于构建各类基因敲除细胞系和基因敲除动物模型。

现有实验技术中，与CRISPR/Cas9系统最为相似的是siRNA靶向的基因沉默技术siRNA是指生物在进化过程中高度保守的双链RNA诱发的基因沉默现象，其影响生物体一系列过程和功能，但在药物等的诱导作用下，被沉默的基因会出现表达回复的现象。与siRNA靶向ALDH2mRNA抑制基因表达相比，CRISPR/Cas9在ALDH2基因组水平进行基因编辑，可以完全沉默基因的表达，构建真正的ALDH2基因缺陷型细胞株。

目前，有必要提供一种不仅能实现沉默彻底、且能长期稳定体外培养的ALDH2基因缺陷型人肝癌细胞株。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了用于敲除人ALDH2基因的sgRNA序列、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及其应用。

第一方面，本发明提供了一种用于敲除人ALDH2基因的sgRNA序列，所述sgRNA的靶DNA序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列中的至少一条。

第二方面，本发明提供了一种敲除人胚胎肾脏细胞ALDH2基因的方法，为利用CRISPR/Cas系统在人肝癌细胞中对ALDH2基因进行改造，具体包括如下步骤：

(1)人工合成如第一方面所述靶DNA序列及其互补链；

(2)将所合成的核酸片段插入到sgRNA骨架表达质粒载体的多克隆位点并转化，挑单克隆菌株，提取sgRNA重组质粒，测序鉴定获得测序正确的sgRNA重组质粒；其中，sgRNA骨架表达质粒载体还表达Cas9核酸酶；

(3)将sgRNA重组质粒转染人肝癌细胞，即得敲除ALDH2基因的人胚胎肾脏细胞。