[发明专利]HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于：该细胞是HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰的T细胞，所述HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR-HC2由Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，scFv的V_H和V_L之间通过(G4S)×3 Linker连接，不同scFv之间通过(G4S)×5 Linker连接。

2. 如权利要求1所述的HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于：所述HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体biCAR-HC2的核苷酸序列如序列表SEQID NO. 1所示。

3. 一种如权利要求1所述的T细胞的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：将通过全基因技术合成的Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域按照顺序串联后，连接到载体pCDH上，包装成携带嵌合抗原受体biCAR-HC2编码基因的慢病毒，利用该慢病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体biCAR-HC2。

4.一种如权利要求3所述的T细胞的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）T细胞的制备：人T淋巴细胞系Jurkat于RPMI 1640培养基培养，加入10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml硫酸链霉素；外周血单核细胞通过Ficoll淋巴细胞分离液分离，细胞在GT-T551培养基中培养，并加入rhIL-2至终浓度为100 IU/mL，按照培养基体积加入5% 自体血清；淋巴细胞的激活扩增：在淋巴细胞培养基中加入MACS GMP TransAct CD3/CD28 Kit (100:1)；37℃，5% CO₂条件下培养24 h后准备感染；

（2）嵌合抗原受体pCDH-biCAR-HC2的构建：将通过全基因技术合成的Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的铰链区和跨膜区、4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域按照顺序串联后，克隆至pUC57-Amp载体上，通过限制性内切酶Xba I和Not I双酶切pUC57-Amp-biCAR-HC2和pCDH目的载体，回收biCAR-HC2片段和pCDH载体；通过T4 DNA ligase连接目的片段和载体，转化Stbl 2感受态细胞；挑取单克隆菌落测序鉴定，鉴定正确的慢病毒表达质粒即为嵌合抗原受体pCDH-biCAR-HC2；

（3）病毒浓缩液的制备：慢病毒表达质粒pCDH-biCAR-HC2与辅助质粒pMD.2G、psPAX按5:2:4的质量比共转染HEK293T细胞，48h后收集病毒上清液，滤膜过滤病毒上清液，再滤液中添加1/4体积的病毒浓缩液Lenti-X concentrator进行混匀，离心后弃上清，沉淀用DMEM培养液溶解，获得病毒浓缩液；

（4）嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰T细胞：将Jurkat细胞与从用病毒转导促进剂Retronectin包被的6孔板中的载体产生细胞中收获的培养上清液混合，离心除去培养物上清液，培养箱中培养过夜；第二天，第二次转导细胞以增加转导效率；除去培养物上清液，培养箱中培养，获得嵌合抗原受体biCAR-HC2修饰的T细胞，该嵌合抗原受体biCAR-HC2的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID NO. 2所示。

5.一种HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于：该细胞是采用权利要求3或4所述的方法制备的。

6.权利要求1或5所述的HIV病毒潜伏库双靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备用于清除HIV-1病毒潜伏库制剂中的应用。