[发明专利]一种小鼠RBM10基因编辑位点及其应用

说明书

本发明公开了一种小鼠RBM10基因编辑位点及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，以pDR274载体为骨架构建插入有小鼠RBM10基因编辑靶位点T1、T2的Cas9 gRNA表达载体，可高效敲除小鼠RBM10基因的编辑位点T1、T2。这两个编辑位点可用于Cas9介导的小鼠RBM10基因打靶，制备RBM10基因修饰小鼠本发明鉴定小鼠RBM10基因的高效编辑位点，并分析其打靶效率，为构建RBM10基因内源性敲除或定点敲入外源基因的转基因小鼠提供新途径。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种小鼠RBM10基因编辑位点及其应用，具体地说，涉及一种小鼠RBM10基因编辑位点T1(241-260)、T2(334-353)及其应用。

背景技术

基因转移技术根据外源基因整合的位点特异性可分为两大类，一类是非定点的，即导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，包括显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、逆转录病毒载体感染等：另一类则是定点的，即外源基因导入靶细胞后整合到预先确定的位点或对细胞内靶位点进行定点修饰，这就是依赖于同源重组的基因打靶技术。将外源基因精准敲入猪体细胞的基因组中，一直都是极为困难的，因为早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到很大的限制。直到近年来人工核酸内切酶(engineered endonuclease,EEN)的出现，才彻底改变了这一现状。

锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease,ZFN)是第一代人工核酸内切酶。锌指是一类能够结合DNA的蛋白质，很多转录因子中都含有锌指结构。ZFN是将锌指蛋白的DNA结构域和FokI核酸内切酶中的非特异性的DNA切割结构域组合形成的一种嵌合体蛋白，其既具有锌指蛋白结合DNA的能力又具有核酸内切酶FokI切割DNA双链的能力(Kim Y G,ChaJ,Chandrasegaran S.Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to FokIcleavage domain.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(3):1156-1160.)。利用ZFN可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。到目前为止，ZFN已经成功应用于猪、牛、大鼠、小鼠、斑马鱼、家蚕、果蝇、海胆、拟南芥、烟草、玉米等生物(Urnov F D,Rebar E J,Holmes M C,et al.Genome editing with engineered zinc finger nucleases.Nat RevGenet,2010,11(9):636-646.)。但是，由于ZFN制备流程复杂，成本昂贵，而且其技术专利被少数几家商业公司所控制，所以推广应用十分有限。