[发明专利]一种尿酸人工抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种尿酸人工抗原的制备方法。

背景技术

尿酸是机体嘌呤代谢的最终产物，人体内的尿酸主要有两种来源，一种是食物中核苷酸分解吸收而来的外源性尿酸约占20%，另一种是人体内核苷酸分解代谢产生的内源性尿酸约占80%，尿酸通过吸收和排泄来维持在体内正常水平。若体内嘌呤代谢异常、食物中嘌呤增加等情况下，会导致尿酸生成过多，人体内尿酸异常是人体疾病的反映，主要反映与嘌呤代谢有关的一些疾病，例如：痛风和Lesch-Nyhan综合症等。近年来，高尿酸与人类疾病的关系研究日益广泛，并且越来越多的证据显示，高尿酸血症与肥胖、高血压、血脂异常、糖尿病、胰岛素抵抗密切相关，并且与心血管疾病和肾损伤相关联。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，高尿酸血症发病率逐渐增加，并且呈现出年轻化的趋势，因此，尿酸的检测和分析在疾病的临床诊断和治疗方面非常重要。

早期的尿酸检测方法是酶法，虽然这种方法操作简便，样品处理简单，但是操作过程太复杂。随后又出现了一系列尿酸检测方法，如：传感器法、伏安法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法，这些方法具有较高的灵敏度和检测特异性，但是所需仪器价格昂贵，需要专业的操作人员进行操作，样品前处理复杂耗时，很难实现现场高通量检测的需求。酶联免疫吸附试验（ELISA）是基于抗原抗体反应的免疫学检测手段，可以实现小分子和大分子的高灵敏、高特异性、高通量的检测需求，这种方法操作简单方便，不需要专业的操作人员，可以应用于现场快速检测，扩大了检测方法的应用范围。实现免疫学方法的前提是获得高灵敏高特异性的抗体，高品质抗体的获得依赖于高效的人工抗原，因此人工抗原的制备是免疫学检测方法成功的关键。

发明内容

要解决的技术问题：现有的尿酸检测方法主要是基于仪器的检测方法，这种方法所需仪器价格昂贵，需要复杂的样品前处理过程，同时需要专业的操作人员，从而限制了此类方法的普遍应用，不能实现现场高通量的检测需求。

技术方案：本发明公开了一种尿酸人工抗原的制备方法，包括如下步骤：

（1）尿酸半抗原的改造

称取20mg尿酸加入到100mL圆底烧瓶中，加入10mL的水溶液，用NaOH溶液将溶液pH调整到9.0使尿酸进行溶解，再加入20~30mg氨基丙酸，最后加入2~4mL纯度为99%的一水合肼溶液，将反应体系置于水浴加热磁力搅拌器上，在100℃的条件下进行冷凝回流反应5~8h后，加入300μL饱和碳酸钠溶液终止反应，并将反应体系自然冷却至室温；反应液用三氯乙酸进行3次萃取，每次三氯乙酸的使用量为15mL，收集三氯乙酸有机相，用旋转蒸发仪将三氯乙酸在50℃的条件下旋干，从而得到改造后的尿酸半抗原。

（2）尿酸人工抗原的合成

将步骤（1）得到的半抗原用2mL N,N-二甲基甲酰胺进行溶解，取入10mL的反应瓶中，将其置于磁力搅拌器上，在磁力搅拌的状态下加入30μL 25%的戊二醛溶液，室温条件下反应30min；将牛血清蛋白BSA用pH7.2的0.01M PBS缓冲液溶解成5mg/mL的浓度，然后在搅拌的状态下将以上反应液逐滴加入到10~20mL 5mg/mL的BSA溶液中，反应4~8h后，将反应液置于透析袋中用pH7.2的0.01M PBS缓冲液进行透析，透析4次后，将溶液从透析袋中取出，即得尿酸人工完全抗原。

（3）人工抗原的鉴定

将步骤（2）制备的人工抗原和BSA溶液进行SDS-PAGE进行分析，人工抗原和5mg/mL的BSA的上样量均为1μL；同时将尿酸、尿酸人工抗原、BSA溶液用紫外分光光度计进行分析。

本发明所述的尿酸人工抗原的制备方法所述的步骤（1）中氨基丙酸的反应添加量为25mg。

本发明所述的尿酸人工抗原的制备方法所述的步骤（1）中99%一水合肼的反应添加量为3mL。

本发明所述的尿酸人工抗原的制备方法所述的步骤（1）中冷凝回流反应时间为7h。

本发明所述的尿酸人工抗原的制备方法所述的步骤（2）中5mg/mL的BSA溶液的反应体积为15mL。

本发明所述的尿酸人工抗原的制备方法所述的步骤（2）中尿酸半抗原和BSA溶液的反应时间为6h。

一种使用步骤（2）合成的人工完全抗原制备尿酸抗体。

将合成尿酸完全抗原免疫BALB/c雄性小鼠，经过四次免疫后得到尿酸的抗体，测定所得抗体的效果和竞争抑制效果。