[发明专利]DVE强弱毒Real time PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明提供鸭病毒性肠炎病毒（DVE）强弱毒实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒，所述引物和探针序列如SEQ ID NO.1‑6所示，具有很高的特异性和灵敏度。当前国内外尚未见可同时对鸭病毒性肠炎病毒（DVE）强弱毒鉴别诊断的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的引物和探针的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术领域

本发明提供鸭病毒性肠炎病毒（DVE）强弱毒实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒，属于动物传染病学领域。

背景技术

鸭病毒性肠炎(duck virus enteritis, DVE)，又称鸭瘟(duck plague, DP)，是由鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)引起的常见于鸭、鹅及其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性、高度接触性传染病。

我国的研究者从上世纪 60 年代开始研制 DVE 弱毒疫苗，其主要途径是将 DEV强毒先在鸭胚上连续传代，然后再转接到鸡胚上长期连续传代，DEV 病毒对鸡胚毒力增强的同时，逐渐丧失了对鸭的致病性，但对其仍保持较强的免疫原性。目前，我国使用的 DEV毒株为细胞传代致弱毒株，在其免疫鸭后几个小时就可产生一定程度的保护力。

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高，目前常用的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标molecular Beacon。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC、ROX、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA等。实时荧光定量PCR技术在检测病原时不仅可以定性检测病原的有无，而且还可以定量分析病毒含量的多少，在病原核酸检测技术上被广泛使用。多重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测多种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。

在疱疹病毒粒子DNA复制过程中涉及到多种酶，其中，由UL2基因编码的尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil-DNA glycosylase，UDG）是DNA修饰不可缺少的酶，它能将复制过程中dUTP错误插入或是胞嘧啶的脱氨基造成的尿嘧啶残基切除，保证DNA复制的正确性和顺利进行。DEV的UL2是单纯疱疹病毒1型(Herpes sim-plex virus type 1，HSV-1)的UL2的同源基因，后者编码尿嘧啶 DNA 糖基化酶，是一个非必须基因，是对病毒复制发挥重要作用的一种酶。对DVE编码的 UL2 基因核酸序列的同源性进行分析发现，DVE强毒株和DVE弱毒株在UL2基因编码区存在较大差异，DVE弱毒株均发生了一个528bp的片段缺失，这段528bp 的序列占了UL2 基因的一半以上，可能导致 UL2 功能的丧失，提示这个片段缺失很可能与弱毒株的毒力减弱直接相关。因此，建立能够同时对DVE强毒株和弱毒株进行鉴别诊断方法尤为重要。