[发明专利]mini-gene剪接报告质粒及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了mini‑gene剪接报告质粒及其构建方法与应用，所述mini‑gene剪接报告质粒具有序列表4001所示序列，通过PCR扩增获得三段DMD基因上的非连续序列，分别插入到pcDNA3.1中构建得到，可用于:1.鉴定和分析外显子及内含子中的剪接调控元件；2.检测微小突变(点突变和微缺失/重复)是否会对外显子的剪接带来影响。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是mini-gene剪接报告质粒及其构建方法与应用。

背景技术

RNA剪接是真核细胞基因表达中非常重要的一个生物过程，通过去除内含子并连接外显子，可以产生许多具有功能的，带有编码信息的mRNA，它对生物的发育及进化至关重要。

mRNA前体的剪接就是在剪接体的催化下，除去内含子并将外显子拼接起来形成成熟的mRNA的过程，是高等真核生物基因表达的必要步骤，也是蛋白质分子多样性产生的关键机制之一。整个剪接过程是在细胞核中完成的，受到精细严格的调控。剪接位点的突变必然引起剪接模式的改变，正确的剪接位点序列及其位置都是保证RNA正常剪接的必要条件。剪接过程需要三个重要的剪接信号，分别是5’剪接位点(供体位点)、3’剪接位点(受体位点)和分支位点(内含子3’端附近)。5’端剪接位点一般是GU加上后续的几个不是特别保守的碱基，3’端剪接位点区域含有多个保守元件，依次是分支点，多聚嘧啶区和内含子3’端的AG。此外，剪接过程还需要一些其它的顺式调控元件的辅助作用，按照它们所在的位置和功能分为外显子剪接增强子(ESE)、外显子剪接沉默子(ESS)、内含子剪接增强子(ISE)、内含子剪接沉默子(ISS)四类。若某些核苷酸的改变影响了剪接信号和作用元件，基因的剪接模式将会改变从而导致某些疾病的发生。另一方面，通过改变基因的剪接模式还可以修饰某些疾病的临床表型。随着反义寡核苷酸药物在临床上的应用和发展，mini-gene可以明确影响剪接模式的特定核苷酸序列，从而为寻找药物治疗靶点提供了一个有效的方法。此外，mini-gene可以通过研究某些化合物对基因剪接模式的的影响来对一些靶向治疗药物进行筛选，可用于脊髓性肌肉萎缩、肌营养不良症、家族性自主神经机能异常症以及其他的遗传性疾病的药物筛选。

一般情况下，这些辅助调控元件通过招募一些反式作用因子即剪接调控蛋白来促进或抑制剪接位点的识别，并能通过调控剪接体的组装来实现对剪接过程的调控。目前已知的剪接调控蛋白主要是富含丝氨酸/精氨酸蛋白(SR蛋白)家族和核不均一性核糖核蛋白(hnRNP)家族。一般情况下，SR蛋白结合在富嘌呤的ESE和ISE上，促进U1snRNP与5’ss结合、U2AF与3’ss结合，还有U4/U6-U5snRNP三聚体组装到剪接体上，进而增强剪接的效率；hnRNP家族成员则通常结合在ESS和ISS上抑制剪接位点识别及使用。通过顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用才能实现正确的剪接过程。

在某些基因中由于剪接的供体、受体部位或其旁侧保守序列的突变，改变RNA前体的剪接方式，使得产生的成熟RNA中含有内含子或缺失外显子序列。剪接模式的正确性依赖于正确的剪接位点，而剪接模式发生错误与疾病关系重大，约1/4的遗传病是由于基因突变改变了正常剪接位点而导致的。由于正常剪接位点与剪接系统有高度的亲和性，一旦剪接点发生突变，会造成相应外显子跳读或邻近的隐蔽剪接位点的活化，这些隐蔽剪接位点存在于内含子或外显子中，因此在成熟mRNA分子中，就会保留一段内含子或缺失掉一段外显子，有时还可使正常基因转变成癌基因。大多数前体mRNA由于长度较大难以对其剪接作用进行研究，而且细胞中的一些内源性基因的突变也会改变剪接模式使得所表达的蛋白功能受到影响，因此对剪接作用的研究也尤为重要。另外，由于人类基因中会发生各种不同的突变，这些突变是否会对基因的剪接带来影响也难以得知，这对掌握突变与剪接以及剪接与疾病之间的关系带来困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种mini-gene剪接报告质粒。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述mini-gene剪接报告质粒的构建方法。