[发明专利]Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法

说明书

本发明公开了一种Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，将大肠杆菌基因组DNA经过超声波片断化，通过末端修复和接头连接，磁珠选择回收后可获得文库定量标准物质，再通过建立的染料数字PCR方法进行量值的确定。本发明提供了标准物质的制备方法，采用片段化的大肠杆菌基因组DNA作为文库定量标准物质，可以更好的模拟实际检测中样本的文库构建。本标准物质的定值方法准确度高，不依赖于DNA标准品，测量结果可溯源至个数，从而保证测量结果的可靠和可溯源。本标准物质可作为测量标准用于illumina平台高通量测序文库DNA的准确定量。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种高通量测序文库定量标准物质的制备方法。

背景技术

基因测序技术和产业开始于1990年启动的人类基因组计划，是被全球生物科技界公认的对人类健康事业影响深远的基础性技术和效益外溢性极强的产业。具有超高测序通量的新一代DNA测序(Next generation sequencing,NGS)推动基因产业以超摩尔定律的速度迅猛发展。基因序列测量的准确性直接关系到人们对于生命活动的判断，例如癌症诊断、品种鉴定等。由于NGS一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的基因组深度测序变得方便易行。

目前市场主流NGS测序仪包括Illumina和Life Technologies公司的测序平台，这两大测序平台文库的定量分析和质量评价对于获得高质量的核酸测序数据十分关键。如果过高的估计测序文库拷贝数，将不能获得足够的测序数据，导致降低数据产出；如果过低的估计测序文库拷贝数，将产生低质量的测序数据，甚至会导致测序失败。因此，要控制NGS测序文库的载入量，保证测序数据的质量，就需要在测序前对DNA测序文库进行定量分析。此外，为减少NGS运行成本，往往需要将不同测序文库等摩尔量合并为一份测序样品同时测序，这也以测序文库的准确定量分析为前提，这样才能保证不同文库的测序数据的可靠性。

目前国内尚无针对高通量测序文库定量标准物质的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法。该方法获得的高通量测序文库定量标准物质量值准确度高，适用性强。

本发明首次建立了高通量测序文库定量标准物质的制备方法，达到了上述发明目的。

本发明的技术方案是：

(1)提取大肠杆菌的基因组DNA，采用超声波进行片断化。

(2)对片断化的DNA进行末端修复，接头连接，磁珠选择性回收可获得文库定量标准物质。

(3)采用染料法数字PCR进行摩尔浓度的确定。

其具体方法为：

步骤(1)中的大肠杆菌的基因组DNA，当被测样本为人基因组时，可替换为其他非人来源的基因组DNA；当被测样本为微生物时,可替换为其它非目标微生物或人源的基因组DNA。大肠杆菌的基因组DNA片断化的DNA长度大小为200bp左右，在连接接头后的长度为355bp左右。

超声破处理片断化的条件为：采用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度：5，时间：2min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10％，爆破/循环：200，温度：4℃；

所述的片断化是指采用超声波处理使其片断化，优选的实验条件为：采用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度：5，时间：6min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10％，爆破/循环：200，温度：4℃；

标准物质的定值方法为数字PCR方法，反应体系为：20μL反应体系：2×SYBR PCRmastermix 10μL，双向引物(10μM)0.4μL，DNA模板4μL，ddH₂O 5.6μL。