[发明专利]一种酵母菌和乳酸菌混合同步发酵制备微生态制剂的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域中的微生物发酵方法，涉及一种产朊假丝酵母和植物乳杆菌混合发酵的方法及制备的微生态制剂在水产养殖中的应用。

背景技术

随着水产养殖业集约化经营模式的提高，残存饵料的腐烂、生物代谢物和生物残体沉积，使池塘有机污染严重，导致有害藻类和病菌的大量繁殖，水质恶化。此外，人类生活污水、各种工业废水、农业退水等的超量排放，进一步污染了养殖用水水源，养殖环境恶化。而抗生素和化学药品的滥用带来了药物在鱼虾体内大量富集残留和病原菌的抗药性等问题，导致水产品质量的下降，既危害了人类健康，也污染了环境。

养殖中后期随着饵料投入量的增加，普遍出现亚硝态氮和氨氮含量偏高现象。亚硝态氮和氨氮中的非离子氨对养殖生物均有很强的毒性。亚硝态氮直接影响养殖生物血液的携带氧能力，是诱发爆发性疾病的主要环境因子，其含量的高低直接关系到水质的好坏和养殖能否成功。非离子氨进入养殖生物体内，对酶水解反应和膜稳定性会产生明显影响，表现为呼吸困难、不摄食、免疫力下降等，养殖生物生长受到抑制甚至中毒死亡。

采用微生物技术修复养殖环境，是水产养殖业健康可持续发展的必然趋势。酵母菌和乳酸菌是水产养殖中常用的菌种，酵母菌主要用于饲料添加，乳酸菌除了用于饲料添加外对水体中亚硝态氮有较强的去除能力。由酵母菌和乳酸菌组成的复合微生态制剂大多是由单一菌剂分别发酵后按一定比例混合而成，此种方法工作量较大，且植物乳杆菌为兼性厌氧菌，单独培养需要特殊装置。酵母菌和乳酸菌有共生作用可以混合发酵，CN101805696B公布了一种除臭酵母菌和乳酸菌共培养方法，该方法步骤为：温度在20-35℃下，先在发酵罐中通气搅拌培养酵母菌2-8h，随后补加乳酸菌菌液，培养18-24h后再次补加乳酸菌菌液培养8-14h，该方法在发酵过程中接种3次增加了染菌风险，所得的菌剂用于垃圾场、餐饮场所、厕所除臭。CN101715877A中酵母菌和乳酸菌放在塑料桶中共培养5-7d，时间周期较长，且发酵过程中需要放气，所得制剂主要用于提高动物免疫力和消化吸收能力。

针对上述方法存在的不足，本发明对酵母菌和乳酸菌混合发酵进行了改进，所得到的微生态制剂能有效降解水体中亚硝态氮、氨氮和pH。

发明内容

本发明的目的是为养殖水体净化提供一种酵母菌和乳酸菌混合发酵制备微生态制剂的方法，在保证有效活菌浓度的前提下简化生产工艺，降低生产成本。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种酵母菌和乳酸菌混合发酵制备微生态制剂的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（a）菌种活化：将产朊假丝酵母菌CGMCC2.281接种到灭菌YPD培养基中，25-30℃振荡培养20-24h，将植物乳杆菌CGMCC1.511接种到装有90%MRS灭菌培养基的玻璃瓶中，30-34℃静置培养24-30h；产朊假丝酵母菌达2.0×10⁸～5.0×10⁸CFU/mL，植物乳杆菌达到5.0×10⁸～8.0×10⁸CFU/mL；所用的YPD培养基指的是：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000mL；MRS培养基指的是：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐温80 1.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL；

（b）培养基的制备：培养基由下列组分按质量百分比组成，糖蜜1.5-2.5%，酵母膏0.5-0.8%，乙酸钠0.3-0.5%，柠檬酸氢二铵0.1-0.2%，西红柿汁5-10%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸锰0.01-0.02%，pH6.0，115℃灭菌20min；

（c）深层混合发酵：用（b）中制备的培养基，同时接入产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌种，接种量按发酵液的体积百分比1%-3%接入，菌种体积比为1:1，培养温度25-31℃，搅拌转数100-150rpm，发酵时间17-23h；

（d）复合微生态制剂的制备：将（c）中的发酵液与凹凸棒土按质量比1:2混合，晾干得到复合微生态制剂，晾干后复合微生态制剂的含水率为8-12%；

（e）包装保存：采用带有塑料内衬的编织袋密封包装，常温保存。