[发明专利]一种溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法和检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生化分析检测技术领域，具体涉及溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

水解酶是催化水解反应的一类酶的总称，广泛分布于人体，对人体新陈代谢以及生物调控等生命活动起着重要作用。溶酶体是细胞中富含多种高浓度酸性水解酶的泡状细胞器，是负责细胞内各种物质分解和消化的重要细胞器。而由于溶酶体酶活性缺失所引起的一系列遗传性代谢性疾病被统称为溶酶体病，而目前临床上常说的溶酶体病主要特指先天性溶酶体病(Congenital Lysosomal Disease)。溶酶体病的发生是由于溶酶体内一种或多种酶的缺陷，导致其代谢物在组织器官内贮积，故又被称为溶酶体贮积症(Lysosomal Storage Disorders)。因此溶酶体水解酶活性的检测在溶酶体病的筛查诊断和预后等方面都有很重要的意义。

其中粘多糖贮积症(Mucopolysaccharidoses，MPS)是我国最常见的一组进行性粘多糖代谢障碍遗传病，占比高达40%。粘多糖贮积症根据缺陷酶的不同可以被分为7型：分别是I、II、III、IV、VI、VII和IX型，其中Ⅲ型被分为ⅢA,ⅢB,ⅢC,ⅢD四个亚型，Ⅳ型又被分为ⅣA和ⅣB两个亚型，虽然各型致病基因和临床表现有差异，但由于贮积的底物都是粘多糖因此统称为粘多糖贮积症。其中粘多糖贮积症II型属于X连锁隐性遗传病，而其他类型均为常染色体隐性遗传。粘多糖贮积症最早是由Brante通过组织化学分析提出。但事实上，早在1917和1919年Hunter和Hurler便已发表相关的临床表现的描述，但是由于其病因一直未明，直至70年代初才确认其属于溶酶体贮积症。其中的MPS II型为分布仅次于戈谢病的疾病，是我国的第二高发的单个溶酶体贮积症（20%）。此外，MPS I型和MPS IV型也是中国人群中较为常见的粘多糖贮积症类型。此组疾病最常见的表现主要为面容粗陋、骨骼异常、伴或不伴有智力落后等，是我国认识和研究稍多的一组疾病。

由于酶具有高度专一的催化活性，故可通过测定其相应的底物或产物浓度变化进而实现对酶活性的检测。目前对于水解酶活性的检测国内外多采用荧光分析法和比色分析法，比色法多以对硝基苯磷酸二纳为显色底物，由于底物在碱性磷酸酶的催化作用下水解生成黄色的末端产物，并且在405nm处有最大吸收峰，从而实现对碱性磷酸酶活性的定量比色分析，但是该方法存在灵敏度低，检测范围窄和抗干扰能力弱等缺点，且底物的稳定性差，易结晶，在光照条件下易分解导致“假阳性”结果。而荧光底物稳定性强，荧光检测具有灵敏度强、特异性高、抗干扰能力强等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低、效率高、稳定性高、抗干扰能力强的能够快速检测溶酶体内酸性水解酶活性的方法及试剂盒。

本发明提出的溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，包括以下步骤：将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液与待测水解酶溶液孵育，水解酶水解底物释放出荧光基团；对于硫酸酯酶，将其水解有机硫酸酯底物使之游离出无机硫酸后形成一个新的不含硫酸基团的底物化合物，该底物可以被另一种水解酶水解，通过添加一定量的水解酶，水解新形成的底物，释放荧光基团；测定反应在355nm处激发光下460nm出的发射光强度；根据荧光强度与荧光物质浓度的标准曲线关系，计算得到荧光物质浓度，通过荧光物质浓度与酶活性之间的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性。

具体来说，本发明提出的检测溶酶体内酸性水解酶活性的方法，具体步骤如下：

（1）将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液（PH为3.5-5.5）与待测水解酶溶液在37℃恒温条件下孵育1-17小时；底物经水解酶水解后释放出荧光基团产生荧光，测定反应在355nm处激发光下460nm处的发射光强度；

（2）根据荧光强度与荧光物质浓度的曲线关系，计算得到荧光物质浓度，荧光标准曲线使用标准荧光物质4甲基伞形酮进行浓度梯度稀释后（0-10nmol/ul，优选1-10nmol/ul）进行荧光检测，通过标准物质浓度梯度与荧光强度进行线性分析计算获得标准曲线方程；

（3）根据荧光物质浓度与酶活性之间的曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性，待测样本经荧光检测获得荧光强度，荧光强度数值通过荧光强度与荧光物质浓度的标准曲线方程计算出荧光物质浓度，通过荧光物质的摩尔浓度可以计算出被水解底物的摩尔浓度，计算单位时间内单位浓度蛋白中水解酶水解底物的量来代表酶活性数值；

检测溶酶体内酸性硫酸酯酶活性的方法，具体步骤如下：