[发明专利]一种制备活化猪血浆凝血因子X的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法，猪血浆用复合层析填料进行柱层析，缓冲液阶段洗脱，收集pH为3.2‑2.8的缓冲液的洗脱液；加入激活剂激活凝血因子Ⅹ；苯甲脒亲和柱层析纯化活化的凝血因子Ⅹ。与现有技术相比，本发明的制备方法通过采用复合层析填料，从猪血浆中纯化制备得到FⅩa，制备方便，减少了分离步骤，提高分离效率，降低成本，且消耗低、收率和纯度高，一定程度上解决血浆来源受限的问题，适合大规模产业化。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备活化猪血浆凝血因子Ⅹ的方法。

背景技术

凝血因子Ⅹ(FⅩ)是一种维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶原，也是一种血浆蛋白，它由两条肽链组成，肽链之间以二硫键相连接。在凝血瀑布反应中，活化的凝血因子Ⅹ(FⅩa)处于内源、外源和共同途径的衔接部位，故在血液凝固的连锁反应中起关键性作用。在正常人的血浆中，凝血因子Ⅹ的含量通常为10μg/ml。

有多种合适的途径可以激活凝血因子Ⅹ，除内源性、外源性凝血途径中的血液成分能够激活凝血因子Ⅹ外，蝰蛇毒中的RVV-X、胰蛋白酶、25％的柠檬酸钠等也可以激活凝血因子Ⅹ。凝血因子Ⅹ的重链上有三个位点可以发生蛋白水解，分别命名为α-位点、β-位点、γ-位点，其中在N末端的为α-位点，在C末端的为β-位点(Mertens,K.and R.M.Bertina,Pathways in the activation of human coagulation factor X[J].Biochem J,1980.185(3):647-658)，因此凝血因子Ⅹ可以水解形成多个活化或者非活化的凝血因子Ⅹ，内源性、外源性凝血途径以及RVV-X等均能将FⅩ活化成为FⅩa。

目前大部分情况下FⅩ和FⅩa主要作为实验试剂被广泛使用，如市面上现有的肝素测定试剂盒(发色底物法)绝大多数采用FⅩa检测肝素。同时，凝血瀑布反应各步骤是一个逐级放大的过程，前一个步骤的反应会对后一个步骤的反应产生影响。因此作为凝血通道上的关键酶，FⅩa是一个很好的抗凝血和抗血栓药物的设计靶标。此外，FⅩa因其具有更高的选择性和更好的稳定性，也常作为限制性内切酶而被应用。如Pharmacia推出的GST系列目的DNA片段的载体，都是将活化的凝血因子Ⅹ设计成内切蛋白酶。因此，高效制备FⅩ及FⅩa是非常意义的。