[发明专利]miR‑1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及药学领域，尤其是一种miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用。

背景技术

胰腺癌是一种发病隐匿、死亡率高的一种恶性肿瘤，早期诊断比较困难，确诊时已到晚期，microRNA为胰腺癌的早期诊断提供希望。 MicroRNA是一种长度为17-22个核苷酸的非编码小RNA，在多种生理过程如细胞的增殖、凋亡、分化等中发挥着重要的作用。研究发现microRNA具有癌基因或抑癌基因的作用，广泛参与肿瘤的发生发展过程。胰腺癌是一种危害比较大的恶性肿瘤之一，了解其分子机制对于胰腺癌的早期诊断具有重要的意义。MicroRNA-1290是近年新发现的一种microRNA，在肺癌、胃癌等组织中均表达，能通过调控细胞周期参与肿瘤的发生发展。

发明内容

本发明的目的是：提供一种miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用，它对胰腺癌侵袭转移具有显著的抑制作用。

本发明是这样实现的：miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用。

miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球作为唯一有效成分。

将miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球与药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的剂型。

为了验证本发明的实验效果，进行了以下体内实验：

1材料和方法

1.1材料

TaqMan MiRNA分析试剂盒购自美国ABI公司，microRNA Reverse Transcription Kit购自美国Applied Biosystems公司，细胞侵袭能力试剂盒购自美国BD Falcon公司，蛋白质分析试剂盒购自美国 Bio-Rad公司，microRNA-1290抑制剂购自美国Ambion公司，COX-2 抗体、MMP-2抗体、羊抗兔抗体均购自美国sigma公司，荧光定量 PCR分析仪(AB7500)。

1.2方法

细胞培养传代：将胰腺癌细胞系接种于25ml的培养瓶中，加入 4ml的含10％胎牛血清、100ug/ml链霉素和100U/ml青霉素的高糖 DMEM培养基中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔24-48h 小时换一次液，待细胞贴壁生长至约80％融合后，进行传代。

免疫组化检测胰腺癌组织的microRNA-1290：通过将病理科收集临床组织标本制成组织芯片，包括30份胰腺癌组织、10份正常癌旁组织，将组织石蜡切片脱蜡、水化、去蛋白、去除内源性过氧化物酶以及预杂交处理，然后与生物素标记的microRNA-1290反义寡核苷酸探针杂交，杂交炉中反应55℃过夜，水洗，加入DAB显色液显色，室温下反应3-5min，水洗后用苏木精复染色，梯度酒精脱水后中性树胶封片，同时设置阴性对照。棕色为阳性，用相应软件计算出 microRNA-1290的光密度值。

FQ-PCR检测microRNA-1290的表达：TRizol法提取胰腺癌细胞系的总RNA，首先按试剂盒说明书配置好逆转录反应液，7μl逆转录反应液，5μl总RNA与3μl逆转录引物混合均匀，进行逆转录反应，逆转录反应程序如下：16℃30min，42℃30min，85℃5min。反应结束后，用三蒸水稀释逆转录产物，2μl的cDNA和1μl TaqMan探针， 10μl TaqMan PCR Mix，7μl三蒸水混合，共20μl反应体系，反应程序如下：95℃10min，95℃15s，60℃60s，共40个循环。

细胞侵袭能力分析：microRNA-1290抑制剂瞬时转染对数生长期的胰腺癌细胞，24h后收集细胞计数，接种4×10⁵个细胞(0.1ml)到 Transwell上室中，下室为0.5ml完全培养基，继续培养24h，弃去Transwell上室的培养基，乙醇固定后，吉姆萨染色，轻轻刮去上表面的胰腺癌细胞，镜检计数。随机选6个视野细胞计数，计算平均值，根据细胞数的变化判断细胞的侵袭能力。

Western Blot检测肿瘤侵袭相关蛋白COX-2、MMP-2的表达： microRNA-1290抑制剂瞬时转染对数生长期的胰腺癌细胞，24h后收集细胞，提取胰腺癌细胞系中的总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，电转移至PVDF膜，5％的脱脂奶粉封闭，加入一抗室温孵育 1h，清洗3次，加入二抗室温孵育1h，清洗3次，加入化学发光底物，拍照。

1.3统计学分析