[发明专利]PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及一种PCR‑ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒及其检测方法，其中试剂盒包含核酸分子标记物标记的检测家蚕微孢子虫的引物对和检测所述核酸分子标记物的ELISA试剂；通过以标记的特异性引物对扩增合适的基因片段，再将扩增产物进行ELISA，筛选的引物具有种特异性，且灵敏度高，可以实现多样本的高通量检测，对家蚕成品卵中家蚕微孢子虫检测具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，还涉及检测方法。

背景技术

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是一种家蚕常见的致病真菌，其引发的家蚕微粒子病是蚕桑产业中毁灭性的病害，因此家蚕微孢子虫一直被各养蚕国家和地区列为法定的蚕业生产检疫对象。为有效控制蚕业生产家蚕微粒子病，以免其引发家蚕灾难性死亡，如何在成品卵阶段完成家蚕微孢子虫的检测成为蚕业科学研究中的重要工作之一。

19世纪60年代，巴斯德(Louis Pasteur)发现并利用家蚕微粒子病胚种传染特点，建立了通过检验母蛾的微粒子病感染情况，淘汰感染母蛾产下的卵，确保子代蚕卵无病的防控技术，并成为家蚕微粒子病防控的关键性技术。随着养蚕或蚕种生产规模、方式和技术等的变迁，该技术也随之得到很大的改进，这种改进主要表现为：单蛾全检发展为集团母蛾抽样检验而使检验效率更高，对一代杂交种采用允许一定病蛾率的判断标准而使检验制度下的蚕种生产更为经济，检测相关设施设备条件的改善使检验结果更加准确等。母蛾镜检法属于间接检查，根据微孢子虫的形态、折光性等特征用显微镜鉴别母蛾体内微孢子虫有无，进而判断蚕卵中是否有存在微孢子虫。其操作简单方便、结果直观易懂，但由于其对检测人员要求很高，母蛾样品准备繁琐，同时在镜检工作中容易将家蚕微孢子虫与真菌孢子、寄主组织碎片等混淆，降低了检测工作的速度和准确度，因此建立直接检测成品卵中家蚕微孢子虫的方法已成为蚕业科学研究的重点。

随着技术的进步以及仪器设备的更新，已经有越来越多的新型检测方法应用于家蚕微孢子虫的检测，大多基于核酸检测，例如PCR法、LAMP法、荧光定PCR等，这些检测方法相对于传统的母蛾镜检来说灵敏度与准确度都更高，但是有些方法操作上对于检验人员的要求较高，需要受过专业的训练，且对仪器设备的依赖较高、成本较高，使得这些方法目前都还停留在实验室研究阶段。因此，研发一种高效、便捷、灵敏、准确、成本较低、通量高的直接检测成品卵中微孢子虫检测方法，对家蚕微粒子病的防控具有重大意义。

1997年，Niemeyer等人创建的PCR-ELISA技术。即将上下游引物进行标记，借助生物素-链酶亲和素系统，PCR产物与预先包被的链霉亲和素的酶标板进行孵育，再加入酶标抗体反应，最后加入底物显色，测定OD值，以此方法检测某种特定基因的存在。此方法弥补了核酸检测的不足，国内外实验均表明PCR-ELISA较琼脂糖电泳灵敏度高出10～100倍；另外酶标仪读出结果客观，主观干扰小；从DNA提取、PCR扩增、再到微孔板孵育显色、判断结果，最快可在一个工作日完成，所用时间短；一块微孔板上可以同时检测多份样品，实现高通量快速检测；所用试剂为常用的缓冲液，配置简便，所用仪器如：酶标仪、PCR仪、温箱，是大多数实验室所具备的，有利于基层推广应用。

综上所述，在本检测方法中，于其核酸扩增过程中加入特殊的标记物，将PCR产物作为抗原进行ELISA检测，可以对样品进行高通量检测且其结果判读客观。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒；本发明的目的之二在于提供PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：